專利名稱：治療肝癌的基因藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療肝癌的藥物，特別是基因藥物，以及該藥物的制備方法。
目前，在基因治療中，首先必須解決組織特異性治療問題，即靶向轉(zhuǎn)染和靶向表達(dá)。靶向轉(zhuǎn)染是利用特異性載體將目的基因特異性地帶到靶細(xì)胞。現(xiàn)有的方法有脂體包埋，局部導(dǎo)入，病毒衣殼蛋白的包裝，利用受體分子制備的配體。這些方法中，首推制備配體分子，因?yàn)樵摪邢蜉d體符合臨床治療模式。
本發(fā)明的目的是提供具有特異性靶向載體的治療肝癌的基因藥物，同時(shí)提供該藥物的制備方法。
該基因藥物是由去唾液酸類粘蛋白(ASOR)與多聚左旋賴氨酸(PL)的復(fù)合物和治療基因以4-6∶1(重量)組成，其中的治療基因是白介素2cDNA為0.91kb，γ-干擾素cDNA為1.1kb，將兩者亞克隆于真核細(xì)胞表達(dá)載體PCDNA3.1(+)的質(zhì)粒中。
上述基因藥物的制備方法是(1)將ASOR，PL和EDC混合溶解后，在PH7.4-7.2，37℃下攪拌反應(yīng)，然后透析除鹽，并分離出ASOR-PL復(fù)合物；(2)將上述得到的ASOR-PL復(fù)合物與治療基因按4-6∶1(重量)充分混合后，過濾除菌。
ASOR作為配體分子對(duì)肝細(xì)胞中的乳糖蛋白分子存在特異性。該去唾液酸類粘蛋白可由類粘蛋白OR，經(jīng)酸解法脫去唾液酸后制成。
本申請(qǐng)人還確定了ASOR-PL與DNA的配比關(guān)系為4-6∶1。當(dāng)靶向載體過剩時(shí)，可競(jìng)爭性地抑制目的基因進(jìn)入肝臟；另一方面，當(dāng)DNA過剩時(shí)，剩余的DNA失去靶向作用。將ASOR-PL和目的DNA分別接0∶1，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1(重量)11個(gè)不同的組合制備藥物。然后在0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行阻滯電泳，電泳的條件為電壓80V，時(shí)間1小時(shí)。電泳后在溴乙錠溶液中染色30分鐘，紫外透射儀檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果如下
比例小于4∶1的能檢測(cè)出未阻滯的目的DNA；比例為4∶1的僅有痕量的未阻滯目的DNA，比例為5∶1時(shí)，全部目的DNA被阻滯。由此說明ASOR-PL與目的DNA的最佳比例為5∶1。
實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的基因藥物能使治療基因定向富集在肝細(xì)胞上。
實(shí)施例1.ASOR-PL復(fù)合物的制備首先將OR用酸解法制備ASOR，然后將ASOR，PL和EDC按1.0∶0.22∶0.45重量比混合溶解后，用NaOH調(diào)PH為7.2，在37℃下攪拌反應(yīng)3小時(shí)后，在蒸餾水中透析48小時(shí)除鹽，再用G50層析柱，在PH7.2-4的緩沖液，10mmolPBS進(jìn)行層析分離，收集第1峰物質(zhì)，進(jìn)行超濾濃縮即得到ASOR-PL復(fù)合物。用Bradford法測(cè)定溶液中ASOR-PL含量。
2.治療基因的重組將含有IFN-r的PHIIF-SV-gamma和含有IL-2的PcDHT-5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入JM-199大腸桿菌中擴(kuò)增，回抽提質(zhì)粒，用BamHI酶切上述質(zhì)粒和真核細(xì)胞表達(dá)的載體質(zhì)粒PcDNA3.1(+)，低溶點(diǎn)膠分離所切片段，以T4DNAligase在膠中連接后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)JM-199菌中，經(jīng)用BamHI酶切篩出陽性克隆擴(kuò)增，純化陽性質(zhì)粒，經(jīng)用DNA序列分析，選出確為含有目的基因序列，并且插入方向正確的克隆再擴(kuò)增回收質(zhì)粒。目的基因片段IL-2CDNA為0.94kb，IFN-rcDNA為1.1kb。
3.ASOSR-PL復(fù)合物與治療基因的連接將ASOR-PL，DNA按5∶1(重量)混合，在37℃下維持1小時(shí)，經(jīng)0.22μm濾膜過濾去菌即可。
藥代動(dòng)力學(xué)研究(1)以該比例制備的藥物經(jīng)靜脈注入SD大鼠體內(nèi)后，用同位素P32-dATP標(biāo)記質(zhì)粒DNA片段，用Southern印跡的方法，發(fā)現(xiàn)其它組織中不存在靶向藥物，說明該藥物的靶向性好。
(2)經(jīng)尾靜脈注入SD大鼠體內(nèi)10-30分鐘時(shí)為血藥高峰期，1小時(shí)后在血中幾乎測(cè)不到。10分鐘后開始在肝臟出現(xiàn)，45分鐘時(shí)出現(xiàn)高峰，并持續(xù)6小時(shí)在高峰水平；24，48，72小時(shí)均可檢測(cè)到較高濃度的基因載體在肝細(xì)胞內(nèi)，8天后僅有微量，10天后測(cè)不到載體質(zhì)粒DNA。
其它組織，除腎臟在30，45，60分鐘可檢測(cè)到載體質(zhì)粒DNA外，其它組織均在注藥1小時(shí)后未能測(cè)出載體質(zhì)粒。
權(quán)利要求
1.治療肝癌的基因藥物，由去唾液酸類粘蛋白(ASOR)與多聚左旋賴氨酸(PL)的復(fù)合物和治療基因以4-6∶1(重量)組成，其中的治療基因是白介素2cDNA為0.91kb，γ-干擾素cDNA為1.1kb，將兩者亞克隆于真核細(xì)胞表達(dá)載體PCDNA3.1(+)的質(zhì)粒中。
2.權(quán)利要求1所述的治療肝癌基因藥物的制備方法(1)將ASOR，PL和EDC混合溶解后，在PH7.4-7.2，37℃下攪拌反應(yīng)，然后透析除鹽，并分離出ASOR-PL復(fù)合物；(2)將上述得到的ASOR-PL復(fù)合物與治療基因按4-6∶1(重量)充分混合后，過濾除菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療肝癌的基因藥物及其制備方法。它是在已知的目的基因上通過多聚左旋賴氨酸(PL)與肝細(xì)胞導(dǎo)向分子ASOR連接。由于ASOR對(duì)肝細(xì)胞中乳糖蛋白分子存在特異性,實(shí)現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)染和靶向表達(dá)。為制備上述藥物,首先將ASOR與PL在EDC、pH7.2條件下反應(yīng),制成ASOR－PL復(fù)合物,然后再與目標(biāo)基因充分混合,利用兩者之間的靜電引力結(jié)合在一起。本發(fā)明提供的基因藥物對(duì)肝細(xì)胞具有特異性。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1256952SQ98112778
公開日2000年6月21日 申請(qǐng)日期1998年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月11日
發(fā)明者盧放根 申請(qǐng)人:湖南醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院