專利名稱：HepG2.2.15細胞自噬小體在制備HBV治療性疫苗中的應用的制作方法
HepG2. 2. 15細胞自噬小體在制備HBV治療性疫苗中的應用技術領域
本發明屬于乙肝疫苗研制技術領域，具體涉及為H印G2. 2. 15細胞自噬小體在制備HBV治療性疫苗中的應用。
背景技術：
乙型肝炎 Ofepatitis B, HB)是由乙型肝炎病毒 Ofepatitis B virus, HBV)引起、危及人類健康的傳染病。目前全球有超過3. 5億HBV感染的慢性乙肝患者或攜帶者，其中我國HBV病毒攜帶者約1.2億。相當一部分會發展成為肝硬化、甚至肝癌。目前治療慢性乙型肝炎藥物主要有干擾素及核苷(酸)類似物。由于靶點的限制，藥物不能有效清除病毒cccDNA，停藥后存在HBV DNA和轉氨酶水平的反彈；長期用藥可致病毒變異，產生耐藥性。
鑒于目前抗病毒治療效果有限，旨在打破機體免疫耐受，有效誘導免疫應答，清除乙肝病毒的治療性疫苗的研發為乙型肝炎治療提供了新思路。目前國外治療性疫苗研究主要有蛋白疫苗、核酸疫苗、T細胞表位肽疫苗等，多停留在實驗室研究或I、II期臨床試驗研究階段。國內主要包括蛋白疫苗和多肽T細胞疫苗等。其中復旦大學研發的治療乙肝慢性感染以鋁鹽為佐劑的免疫復合物疫苗，目前已進入III期臨床試驗研究階段；第三軍醫大學研發的多肽疫苗已完成II期臨床。雖然治療性疫苗能誘導針對HBV的免疫反應，但對 HBV病毒抑制和血清學改變等總體療效并不穩定，至今尚無治療性疫苗批準上市。因此，新型治療性乙肝疫苗的研制具有重要的意義。
由于缺乏HBV肝炎小鼠模型及有效的HBV抗原交叉提呈，治療HBV慢性感染，阻斷肝細胞內HBV的復制和表達、誘導有效的免疫應答仍是目前難題之一。Chen等構建的HBV DNA載體pAAV/HBVl. 2x,采用尾靜脈高壓注射法在正常C57BL/6小鼠體內，成功建立了 HBV 肝炎小鼠模型，使得HBV復制及抗原表達長達一年，該新型小鼠模型為研究HBV慢性感染的病毒學和免疫學機制提供了首要條件。發明內容
本發明所要解決的技術問題，是提供H印G2. 2. 15細胞自噬小體在制備HBV治療性疫苗中的應用。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下
H印G2. 2. 15細胞自噬小體HBV-DRilAles在制備HBV治療性疫苗中的應用。
根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的H印G2. 2. 15細胞自噬小體按如下步驟制備得到
(1) H印G2. 2. 15肝癌細胞的培養
復蘇凍存細胞，用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的 DMEM培養基，在37°C、5% (v/v) CO2的恒溫培養箱中培養，每1 2天換液一次，常規0. 25% (g/mL)胰蛋白酶消化傳代；
(2)HepG2. 2. 15肝癌細胞的處理
待步驟(1)培養后的細胞貼壁良好，密度適中后(所述的密度適中是以細胞單層均勻鋪滿培養板底部約80-90%的面積確定)，加入雷帕霉素(Rapamycin)、萬珂(Velcade) 和氯化銨(NH4CL)，雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為1 OOnmo 1 /L、200nmo 1 /L和 30mmol/L，干預H印G2. 2. 15細胞16小時，誘導自噬小體HBV-DRibbles ；
(3)提取 HBV-DRibbles
將步驟(2)誘導后的細胞經離心得到沉淀，即為自噬小體HBV-DRilAles。
步驟(3)中，提取HBV-DRilAles具體包含如下步驟
(3a)將細胞及培養液倒入普通50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；
(3b)將步驟(3a)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm， 30min,4°C ；
(3c)將步驟(3a)離心后的沉淀的細胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，IOminJf 低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C ；
(3d)將步驟(3b)和(3c)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm 高速離心30min，4°C ；
(3e)棄步驟(3d)得到的上清，沉淀即為自噬小體HBV-DRibbles,將沉淀用Iml PBS重懸后分裝，凍存于-20°C，備用。
腫瘤細胞來源的自噬小體(DRitDbles)是交叉提呈腫瘤抗原的有效載體，能有效誘導抗腫瘤的細胞免疫應答。提取自藥物處理的H印G2. 2. 15細胞(轉HBV全序DNA的人肝癌細胞，不僅可以產生腫瘤抗原，也可以產生HBV抗原)的自噬小體，可募集更多的HBV 抗原成分，即HBV-DRitDbles ；以HBV-DRitDbles疫苗誘導DC細胞的交叉遞呈，以期更有效地激發針對HBV特異性的CD8+T細胞應答，清除HBV病毒感染的肝細胞。
有益效果本發明首次發現HBV-DRitDbles作為一種新型交叉提呈的抗原載體， 免疫小鼠能產生HBV特異性的細胞免疫應答，抑制HBV感染小鼠模型的HBV病毒復制，有效清除HBV感染的肝細胞，效果優于只有單純保護作用的重組HBsAg疫苗。本發明首次以 HBV-DRibbles疫苗誘導DC細胞的交叉遞呈，更有效地激發針對HBV特異性的⑶8+T細胞應答，清除HBV病毒感染的肝細胞。為乙型肝炎的治療提供新的思路。


圖1為電鏡觀察DRibbles的形態X 10000。
圖 2 為 DRibble 中 LC3 含量的變化。其中，1. +DMEM ；2. +Velcade ；3. +Rapamycin, 4. +Ve1cade+Rapamycin 5. +Velcade+Rapamycin+NH4C1。
圖3為不同藥物單獨處理H印G2. 2. 15細胞對HBV-DRilAles中HBV抗原含量的影響。
圖4為萬珂、雷帕霉素和氯化銨聯合作用H印G2. 2. 15細胞對HBV-DRilAles中 HBsAg、HBeAg含量的影響。
圖5為HBV-HBV-DRilAles疫苗免疫小鼠誘導產生特異性體液免疫應答。
圖6. HBV-DRibbles疫苗免疫小鼠誘導產生特異性細胞免疫應答。
圖7. Q-PCR法檢測疫苗免疫HBV感染模型小鼠血清中HBV-DNA拷貝數。
圖8.免疫組織化學法檢測疫苗免疫HBV感染模型小鼠的HBcAg陽性肝細胞。
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
實施例1 :H印G2. 2. 15細胞自噬小體HBV-DRilAles的制備。
1. H印G2. 2. 15肝癌細胞的培養
復蘇凍存細胞，用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的 DMEM培養基，在37°C、5% (v/v) CO2的恒溫培養箱中培養，每1 2天換液一次，常規0. 25% 胰蛋白酶消化傳代。
2. H印G2. 2. 15肝癌細胞的處理
待細胞貼壁良好，密度適中后，加入雷帕霉素lOOnmol/L、萬珂200nmol/L、氯化銨 30mmol/L組合，干預H印G2. 2. 15細胞16小時，誘導自噬小體HBV-DRibbles。
3.提取 HBV-DRibbles
藥物處理細胞16小時后，收獲細胞，經離心提取上清中的DRibbles。具體步驟如下
1)將細胞及培養液倒入普通50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；
2)將步驟1)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm， 30min,4°C ；
3)將步驟1)離心后的沉淀的細胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，lOmin，將低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C ；
4)將步驟2)和步驟3)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm 高速離心30min，4°C ；
5)棄步驟4)得到的上清，沉淀主要成分即為自噬小體HBV-DRilAles。將沉淀用約ImlPBS重懸后分裝，凍存于-20°C，備用(避免反復凍融)。
實施例2 透射電子顯微鏡鑒定HBV-DRibbles的形態。
將提取好的HBV-DRitDbles高速離心使其壓縮緊密，棄上清，沉淀用2. 5% (ν/ν)戊二醛固定，送電鏡室進行處理，上鏡觀察HBV-DRitDbles的形態。如圖1所示電鏡下可見含膜結構的小體，平均直徑約為200-300nm(箭頭所指)，證實有效募集了肝癌細胞的自噬小體。
實施例3 =HBV-DRibbles總蛋白含量測定(Bradford法)。
1)完全溶解蛋白標準品，取25 μ 1用PBS稀釋至100 μ 1 ；
2)將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μ 1分別加到96孔板中，加PBS補足到 20μ 1 ；
3)提前將待測DRibbles反復凍融，離心取上清，加適量體積樣本到96孔板中，加 PBS補足到20 μ 1 ；
4)各孔加入200 μ 1 G250染色液，室溫放置3_5分鐘；
5)用酶標儀測定595nm，或560_610匪之間其它波長的吸光度；
6)用軟件ElisaCalc繪制標準曲線，根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。
每次提取蛋白濃度不完全相同，大約為1_3μ g/μ 1。
實施例4 =Western blot檢測HBV-DRibbles中自噬標記蛋白一LC3的表達。
1)制備分離膠和濃縮膠
A分離膠(15%)制備:
ddH200.8 ml
30%Arc1.75 ml
1.5M Tris-Hcl (pH8.8)0.9ml
10%SDS35 ul
10%APS35 ul
TEMED1.5ul
總體積3.5ml。8濃縮膠(5%)的制備
ddH201.05ml
30%Arc0.25ml
1.0M Tris-Hcl(pH6.8)0.19ml
lO%SDS15 ul
lO%APS15 ul
TEMED1.5 ul
總體積1.5ml。2) SDS-PAGE 電泳
待濃縮膠凝固后，用去離子水沖洗梳孔。取反復凍融后離心所得的上清，根據蛋白定量結果調整上樣量，細胞裂解物每孔約12μ 1，加入5XSDS樣品加樣緩沖液3μ 1混勻， 100°C煮沸5min，12000rpm離心5分鐘后棄沉渣取上清準備上樣。并加入蛋白分子量標準， 在上、下槽中加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，開始電泳，恒壓80V，待樣本進入分離膠后，加大電壓至120V，待溴酚藍移動至膠板底部時終止電泳。
3)轉膜
轉膜開始前約半小時，將轉移裝置浸泡于預冷的轉移緩沖液中，待電泳結束后，取下膠板，根據目的蛋白分子量切下相應大小的膠，浸泡于轉移緩沖液中，根據膠的大小剪出適當大小的PVDF膜，浸泡于甲醇溶液中，待膜浸透后移至轉移緩沖液中繼續浸泡20分鐘， 制備“三明治”。恒流250mA電轉移60min。
4)封閉
用0. 05% TBST浸泡洗滌PVDF膜5min后，置于含3%牛血清白蛋白TBST中室溫慢搖封閉1小時
5) 一抗孵育
TBSTl 1000稀釋抗-HBsAg單克隆抗體，4°C過夜。次日TBST洗滌3次，每次洗滌10分鐘，搖床振動幅度120轉/分鐘
6) 二抗孵育及顯影
TBST 1 5000稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫，搖床孵育1小時；TBST洗滌3次，每次洗滌10分鐘，搖床振動幅度120轉/分鐘；以ECL超敏發光底物曝光顯影。
如圖2所示5組HBV-DRitDbles中均檢測到自噬特征性標記物LC3-II的表達， 第5組的LC3 — II顯著高于其他4組。提示自噬誘導劑雷帕霉素雖促進了自噬小體的生成，但由于自噬小體與溶酶體融合的降解途徑未被阻斷，自噬小體的降解未受抑制，因而 HBV-DRibbles中自噬小體的總量無明顯增加；而采用NH4Cl處理細胞抑制了溶酶體的酸化，阻止了溶酶體對自噬小體的降解，因而從NH4Cl處理組募集到的HBV-DRitDbles富含自噬小體。推測采用萬珂、雷帕霉素及NH4Cl處理H印G2. 2. 15細胞可以更有效地募集自噬小體。
實施例5 =HBV-DRibbles中HBsAg、HBeAg表達量的檢測(相對定量)。
按“乙型肝炎HBsAg、HBeAg診斷試劑盒”說明書操作。
1)提前將待測HBV-DRitDbles反復凍融，離心取上清；
2)酶標條每孔加入待測標本50 μ 1，設陰、陽性對照各2孔，每孔加入陰性對照 (或陽性對照)各50 μ 1，并設空白對照1孔；
3)每孔加入酶結合物50 μ 1 (空白對照孔除外)，充分混勻，封板，置37°C孵育30 分鐘；手工洗板棄去孔內液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復5次后拍干；
4)每孔加顯色劑A液、B液各50 μ 1，充分混勻，封板，置37°C孵育15分鐘；每孔加入終止液50微升，混勻；
5)酶標儀波長450nm(參考波長630nm)測定各孔OD值。
結果
A.圖3顯示不同藥物單獨處理H印G2. 2. 15細胞對HBV-DRilAles中HBV抗原含量的影響。
1)萬珂對HBV-DRibbles中HBV抗原含量的影響
對生長密度適中、貼壁良好的H印G2. 2. 15細胞加入萬珂(濃度分別為60、200、 600nM)處理M小時，提取培養上清中的HBV-DRilAles并采用ELISA法檢測其中HBsAg 和HBeAg含量。結果顯示200nM的萬珂能顯著提高HBV-DRibbles中的HBsAg含量(p = 0.0113)，同時顯著提高HBV-DRilAles中的HBeAg含量(p = 0.0082)。提示蛋白酶體抑制劑萬珂能提高HBV-DRitDbles中HBV抗原含量。
2)雷帕霉素對HBV-DRilAles中抗原含量的影響
對生長密度適中，貼壁良好的H印G2. 2. 15細胞加入濃度分別為30ηΜ、ΙΟΟηΜ、 300nM的雷帕霉素誘導M小時后，提取培養上清中的HBV-DRilAles，ELISA法檢測HBV-DRilAles中HBsAg和HBeAg含量。結果顯示IOOnM的雷帕霉素均明顯增加 HBV-DRibbles 中 HBsAg 含量和 HBeAg 含量(p = 0. 0452、ρ = 0. 0134)。提示自噬誘導劑雷帕霉素能夠提高HBV-DRitDbles中HBV抗原的含量。
3)氯化銨對HBV-DRilAles中抗原含量的影響
對生長密度適中、貼壁良好的H印G2. 2. 15細胞加入濃度分別為3、10、30(mM)的氯化銨處理24小時后提取培養上清中的HBV-DRilAles，ELISA法檢測HBV-DRilAles中 HBsAg和HBeAg含量。結果顯示30mM的氯化銨對HBV-DRilAles中的HBsAg含量沒有明顯的影響，但增加了 HBV-DRitDbles中的HBeAg含量(p = 0. 0028)。提示氯化銨能夠提高 HBV-DRibbles 中 HBeAg 的含量。
B.圖4顯示三種藥物聯合作用H印G2. 2. 15細胞對HBV-DRibbles中HBsAg、HBeAg 含量的影響。
為進一步觀察3種自噬相關藥物萬珂、雷帕霉素和氯化銨聯合處理H印G2. 2. 15 細胞對HBV-DRitDbles內HBV抗原含量的影響，將3種藥物按上述最佳作用濃度聯合處理 HepG2. 2. 15細胞24小時，ELISA檢測HBV-DRibbles中的HBsAg和HBeAg。結果顯示與未處理的對照組相比，3種藥物聯合作用細胞可顯著提高HBV-DRitDbles中HBsAg和HBeAg 含量(p = 0. 0004、p = 0. 0007)。提示3種藥物聯合作用H印G2. 2. 15細胞，有效提高了 HBV-DRibbles 中 HBV 抗原含量。
實施例6 =HBV-DRibbles中HBsAg含量測定(絕對定量)。
步驟同實施例5。
不同之處在于
1)于加樣同時加倍比稀釋的HBsAg標準品，50 μ 1/孔。
2)酶標儀檢測后用軟件ElisaCalc繪制標準曲線，根據標準曲線計算樣品中 HBsAg濃度。
每次提取結果不完全相同，HBsAg含量約Ι-aiig/ μ 1。
實施例7 =HBV-DRibbles疫苗淋巴結免疫小鼠。
1)將小鼠置于小型動物麻醉機中，異氟烷全身吸入式麻醉；
2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠剪開腹部皮膚勿傷及腹膜，暴露兩側腹股溝位置的皮下淋巴結；
3)然后每側分別注射40 μ g/20 μ 1 HBV-DRibbles ；對照組每側注射HBsiVg重組疫苗 40 μ g/20 μ 1 ；
4) 2周后分別皮下注射加強免疫HBsAg重組疫苗免疫000 μ g/200 μ 1/只)和 HBV-DRibbles免疫(400 μ g/200 μ 1/只)，2周后重復加強1次；
5)5周后小鼠眼眶采血300μ 1/只，室溫放置2小時后，4°C過夜，6000rpm離心10分鐘分離收獲血清。
實施例8 =ELISA檢測血清中HBs-IgG抗體的產生。
按“乙型肝炎表面抗體診斷試劑盒”說明書操作
1)提前將待測HBV-DRitDbles反復凍融，離心取上清；
2)酶標條每孔加入待測標本50 μ 1，設陰、陽性對照各2孔，每孔加入陰性對照 (或陽性對照)各50 μ 1，并設空白對照1孔；
3)每孔加入酶結合物50 μ 1 (空白對照孔除外)，充分混勻，封板，置37°C孵育30 分鐘；手工洗板棄去孔內液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復5次后拍干；
4)每孔加顯色劑A液、B液各50 μ 1，充分混勻，封板，置37°C孵育15分鐘；每孔加入終止液50微升，混勻；
5)酶標儀波長450nm(參考波長630nm)測定各孔OD值。8
圖5結果顯示HBV-DRilAles免疫組的小鼠抗HBs IgG的A450nm值大約在0. 42 左右，HBsAg重組疫苗免疫組小鼠抗HBs IgG的A450nm值大約為0. 18，HBV-DRibbles免疫誘導抗HBs IgG水平顯著高于HBsAg重組疫苗(p = 0. 03)。提示=HBV-DRilAles誘導的體液免疫效果優于重組HBsAg組。
實施例9 =ELISA法檢測HBV抗原再刺激HBsAg特異性脾細胞產生的IFN- γ含量
按實施例7中DRibbles及HBsAg重組疫苗免疫小鼠，待小鼠血清中抗HBs抗體檢測陽性時，處死小鼠，取脾臟及淋巴結細胞。步驟如下
(1)每組處死3只小鼠，75%乙醇浸泡5min，在超凈工作臺內無菌取脾及淋巴結， 放入冷Hanks液中漂洗2次；
(2)用無菌磨砂玻片將脾臟及淋巴結碾碎并濾過200目無菌不銹鋼網，收集細胞懸液，置50ml離心管中離心1500rpm，離心IOmin ；
(3)棄上清，加入紅細胞裂解液溫和混勻，靜置5min，1500rpm，離心IOmin ；
(4)棄上清，再用Hanks液漂洗1次，細胞計數，用含10%小牛血清的RPIM1640完全培養液調整細胞濃度至2 X 106/ml ；
(5)設 HBcAg、HBsAg 刺激組(其中 HBcAg 設 500ng/ml，50ng/ml，Ong/ml、HBsAg 設 100ng/ml,30ng/ml,0ng/ml三個濃度)，與淋巴細胞共同培養于M孔板中；
(6)收集72小時的培養上清，ELISA法檢測上清中IFN- γ含量。
結果見實施例10。
實施例10 培養上清中IFN- γ含量檢測。
按e-Bioscience ELISA試劑盒說明書操作。
1)包被捕獲抗體10Ρμ1，4度過夜；
2)棄去孔中液體，洗滌5次；
3)每孔加入稀釋液20Ρμ1，封閉，室溫孵育1小時；
4)棄去孔中液體，洗滌5次；
5)每孔加入ΙΟΡμΙ倍比稀釋的標準品，以繪制標準曲線。樣本每孔加ΙΟΡμΙ，封板，室溫孵育2小時；
6)棄去孔中液體，洗滌5次；
7)每孔加入ΙΟΡμΙ檢測抗體，封板，室溫孵育1小時；
8)棄去孔中液體，洗滌5次；
9)每孔加入100)4 HRP標記親和素，封板，室溫孵育半小時；
10)棄去孔中液體，洗滌7次；
11)每孔加入ΙΟΡμΙ顯色液，室溫孵育15分鐘；
12)每孔加入50 μ 1終止液；測定450nm波長處吸光數。
圖6結果顯示重組HBsiVg疫苗免疫小鼠可產生針對HBsiVg的細胞應答，而與重組 HBsAg疫苗相比，HBV-DRitDbles免疫小鼠不僅產生了針對HBsAg的細胞與應答，還產生了高水平的針對HBdg抗原的細胞應答，差異具有明顯統計學意義(ρ < 0. 001)。提示富含抗原的HBV-DRitDbles比重組HBsAg疫苗更能有效刺激效應T細胞、干擾素的分泌，誘導產生更強的特異性細胞免疫應答。
實施例11 乙型肝炎小鼠模型的建立。
采用尾靜脈高壓注射法注射C57BL/6小鼠，IOyg pAAV/HBVl. 2質粒，于5_8s注射完成，注射劑量為小鼠體重8%。
實施例12 =HBV-DRibbles疫苗治療HBV感染小鼠模型。
HBV-DRibbles和重組HBsAg疫苗免疫C57BL/6小鼠(同步驟7)，待血清HBs-IgG 抗體檢測陽性后，尾靜脈高壓注射法注射IOyg pAAV/HBVl. 2質粒，于質粒注射后第1、2、 4、6周，定期眼眶靜脈采血，收集血清樣本。同時設立重組HBsAg免疫小鼠對照組。ELISA 法檢測HBV抗原、熒光定量PCR法檢測HBV-DNA拷貝數、末次采血時處死小鼠，取肝臟， 4%甲醛固定，石蠟包埋，切片，免疫組織化學染色法檢測HBcAg陽性肝細胞數。以探討 HBV-DRibbles疫苗對HBV感染的小鼠模型的治療作用，并與重組HBsAg比較。
實施例13 Q-PCR檢測小鼠血清中的HBV-DNA拷貝數。
按乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)試劑盒說明書操作。核酸提取
1)吸取100 μ 1樣品處理液A于0. 5ml離心管中。
2)加入100 μ 1被測樣本
3)蓋上管蓋，震蕩混勻，13000rpm離心10分鐘
4)吸棄上清
5)再加入25 μ 1樣品處理液B
權利要求
1.H印G2. 2. 15細胞自噬小體HBV-DRilDbles在制備HBV治療性疫苗中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的IfepG2.2. 15細胞自噬小體按如下步驟制備得到(1)H印G2.2. 15肝癌細胞的培養復蘇凍存細胞，用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM 培養基，在37°C、5% (v/v)CO2的恒溫培養箱中培養，每1 2天換液一次，常規0. 25%胰蛋白酶消化傳代；(2)HepG2.2. 15肝癌細胞的處理待步驟(1)培養后的細胞貼壁良好，密度適中后，加入雷帕霉素、萬珂和氯化銨，雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干預H印G2. 2. 15 細胞16小時，誘導自噬小體HBV-DRibbles ；(3)提取HBV-DRibbles 將步驟⑵誘導后的細胞經離心得到沉淀，即為自噬小體HBV-DRilAles。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟(3)中，提取HBV-DRitDbles具體包含如下步驟(3a)將細胞及培養液倒入50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；(3b)將步驟(3a)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm， 30min,4°C ；(3c)將步驟(3a)離心后的沉淀的細胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，lOmin，將低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C ；(3d)將步驟(3b)和(3c)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm高速離心 30min，4°C ；(3e)棄步驟(3d)得到的上清，沉淀即為自噬小體HBV-DRilAles，將沉淀用Iml PBS重懸后分裝，凍存于_20°C，備用。
全文摘要
本發明公開了HepG2.2.15細胞自噬小體HBV-DRibbles在制備HBV治療性疫苗中的應用。本發明首次發現HBV-DRibbles作為一種新型交叉提呈的抗原載體，免疫小鼠能產生HBV特異性的細胞免疫應答，抑制HBV感染小鼠模型的HBV病毒復制，有效清除HBV感染的肝細胞，效果優于只有單純保護作用的重組HBsAg疫苗。本發明首次以HBV-DRibbles疫苗誘導DC細胞的交叉遞呈，更有效地激發針對HBV特異性的CD8+T細胞應答，清除HBV病毒感染的肝細胞。為乙型肝炎的治療提供新的思路。
文檔編號A61K39/29GK102499983SQ20111043777
公開日2012年6月20日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者曹萌, 王立新, 薛萌 申請人:東南大學