專利名稱：一種胚胎營養素的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是雞胚營養素(chicken embryonin，CENIN)的技術領域。
本發明的目的在于提供一種采用生化提取和中空纖維超濾制備高濃度，高產量，低成本和活性高的雞胚營養素(CENIN)的制備方法，原材料選用健康禽類動物如雞、鴨、鴿、鵝等的孵化蛋胚胎組織，可以制成口服液，也可制備注射藥。
本發明的目的可通過以下的技術措施來達到選用健康禽類動物如雞、鴨、鴿、鵝等的孵化蛋胚胎組織，用任何機械方法搗碎→-20℃深凍→加熱70-90℃，15-30min→恢復至室溫，凍存→融化后，離心，取上清液→過正壓截留柱→取濾液→除菌→分裝，包裝→制備注射藥/或加調味劑制作抗衰老口服液/或膠囊/或加賦型劑制造美容護膚品。。
本發明的目的也可通過以下的技術措施來達到在上述方案中，健康禽類動物可選自雞、鴨、鴿、鵝等在上述方案中，加熱溫度可從40-95℃優選70-90℃和時間從10-100min，優選15-30min。
在上述方案中，截留柱的截止分子量為1000-100,000道爾頓。正壓0.1-1.0×104Pa，其組合方式為單柱或多柱組合使用。
在上述方案中，所制備的雞胚營養素(CENIN)，截止分子量≤1,000,000道爾頓時，在制備過程到除菌一步時加入調味劑分裝成品可制成抗衰老口服液和截止分子量≤20,000道爾頓時可制成注射液，或與其它藥物配伍靜脈滴入給藥。
本發明方法進一步的優選方案如下選用健康禽類動物如雞、鴨、鴿、鵝等的孵化蛋胚胎組織，用任何機械方法搗碎→-20℃深凍→加熱70-90℃，15-30min→恢復至室溫，-10℃凍存→融化后，離心，取上清液→過0.1-1.0×104Pa正壓截留柱，截止分子量為1000-100,000道爾頓→取濾液→除菌→分裝，包裝→制備注射藥/或加調味劑制作抗衰老口服液/或膠囊/或加賦型劑制造美容護膚品。。
實施例1雞胚提取物的制造禽類胚胎組織，勻漿，-20℃深凍→融解后加熱→恢復至室溫，-10℃凍存→融解后，離心→取上清液→過正壓截留柱→取濾液→除菌→分裝→制成注射液/口服液，每毫升含蛋白5.0mg(蛋白含量測定采用改良Lowry′s法)。
本發明的目的是采用生化提取利用中空纖維超濾技術制備雞胚營養素(CENIN)；同目前最先進的方法相比，具有濃度高，產量高，活性高和成本低的特點。
實施例2雞胚提取物的生物學活性鑒定1、雞胚成纖維細胞的分離取10齡雞胚，去頭及內臟，剪碎，加入0.25％的胰酶，室溫下消化30-60min；分離懸浮的單個細胞，離心，去胰酶，用含10％小牛血清的DMEM培養基調細胞濃度為5-10×108/L；用培養瓶培育2小時，倒去上清，加含10％小牛血清的DMEM培養基繼續培養，等細胞長滿后，用胰酶消化貼壁細胞做活性測定試驗。
2、生物學活性測定調細胞濃度為4.0-8.0×108/L接種于96孔培養板，0.1ml/孔。置37℃5％CO2，24小時后換液，加入添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的雞胚提取物，以1.0×106μ/L FGF為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照孔。72小時后，棄上清。96孔板加含0.15g/LMTT和2mci/L3H-Tdr F12培養液0.05ml。培養4小時，分別做MTT比色和3H-Tdr摻入的技術操作。
3、結果3.1雞胚提取物對培養72小時雞成纖維細胞增殖的影響。
在普通培養基的基礎上分別添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的雞胚提取物，觀察它們對雞成纖維細胞DNA合成的影響(表1)。表1雞胚提取物對成纖維細胞3H-TdR摻入的影響(X±SD，n=8) 濃度(％)cpm20 1194±15210 1805±2805 2755±431*2.5 3506±1302**1.25 3019±1381**0.5 2713±834*bFGF 3135±727**對照組1641±334注*，P＜0.05，**，P＜0.01，同對照組比較。
結果顯示雞胚提取物能明顯促進雞成纖維細胞的DNA合成。3.2雞胚提取物對培養72小時雞成纖維細胞活力的影響。在普通培養基的基礎上分別添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的雞胚提取物，觀察它們對雞成纖維細胞增殖的影響(表2)。表2雞胚提取物對雞成纖維細胞脫氫酶活力的影響(x±s，n＝5)濃度(％)0D值20 0.180±0.03610 0.199±0.0485 0.219±0.0482.5 0.250±0.0921.250.248±0.0830.5 0.184±0.029bFGF0.248±0.047對照組(0) 0.185±0.046注*，P＜0.05，**，P＜0.01，同對照組比較。
實施例3雞胚提取物對雞胚胎干細胞生長的影響1、材料1.1新鮮美國海南白雞種蛋(由廣東力康農工商集團公司提供)，按Eyal-Giladi和Kochav方法[3]分期為IX～XI期，分離雞胚盤細胞限產蛋后5hr以內。
1.2進口特級胎牛血清(FBS，Gibco)、國產FBS和國產新生小牛血清(NCS；由杭州四季青生物工程材料研究所提供)。DMEM(高糖，無丙酮酸鈉，sigma)，非必需氨基酸(×100，Gibco)，鼠白血病抑制因子(mouse leukiemia inhibitory factor，mLIF，106M，Gibco)和人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，10ug，Gibco)，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME；Nacalai Tesoue INC Kyota，Japan)，伴白蛋白(Conalbumin，Sigma)。快藍BB鹽(Fast blue BB salt，Sigma)和萘酚-AS-MX(Naphthol ASMXphosphate，Sigma)。
1.3 ES細胞培養基10％國產NCS，40ng.ml-1伴白蛋白，1％非必需氨基酸，1000u.ml-1mLIF，10ng.ml-1的人bFGF，5％FBS(國產或進口)和0.14mM的β-ME的高糖DMEM培養基。
2.雞胚成纖維細胞(chicken embryonic fibroblast，CEF)飼養層的制備取雞胚(8～12日齡)，去除內臟及頭，剪碎，胰酶分步消化。按1×105～2×105.ml-1分板或分瓶培養，12hr換液。細胞長滿后應及時用胰酶傳代。用做ES細胞培養的飼養層細胞，大約應為80％～90％滿瓶生長。用前用含10ug.ml-1絲裂霉素-C培養基處理2～3hr，PBS洗滌三次后用基礎培養基培養直至用于分離或傳代ES細胞。
3.雞胚盤細胞分離 分離的胚盤用0.25％的胰酶消化成小細胞團，用含5.6nM的D-葡萄糖(PBS-G)洗滌三次后用基礎培養基培養，24小時后換液，3～5d后傳代至絲裂霉素-C處理過的飼養層細胞上培養。改換完全ES細胞培養基。
4.雞胚胎干細胞培養 雞胚盤細胞于37℃、5％CO2、濕度99％中常規培養，每24hr換液一半。3～5d傳代一次，傳代時先用PBS-G洗滌三次，0.25％胰酶37℃消化5～10min。分離的ES細胞團重新接種于絲裂霉素-C處理過的飼養層細胞，用完全ES細胞培養基常規培養。于細胞傳代時用倒置顯微鏡計數ES細胞集落數。
5.堿性磷酸酶反應取傳代胚盤細胞分別于第一代，第三代，第九代終止培養，培養細胞用PBS洗滌三次，用冷的4％多聚甲醛于4℃固定15min。PBS洗滌，于AKP液(配方①5mg快藍BB鹽+50μlHCl+200μl雙蒸水。②2.5mg萘酚-AS-MX+100μl DMSO+5ml 0.1MTrisHCl(pH8.2-9.2)+100μl 10％MgCl2。將①+②混合，調pH至8.4)中37℃孵化5～30min，用10nM EDTA終止反應，PBS沖洗，用倒置顯微鏡計數ES細胞陽性集落。
6、結果6.1雞胚盤細胞初次傳代時的表現從新鮮海南白雞種蛋的胚盤細胞中分離培養雞ES細胞，從細胞的生長方式、形態學特征和AKP染色觀察識別，可見以下4種集落ES細胞集落，細胞小，排列緊密，界限不清，集落呈團狀、山丘狀或鳥巢狀生長。此外還可見滋養層細胞集落，上皮樣細胞集落，內皮樣細胞集落。ES細胞集落在最初幾代的傳代過程中很容易分化，需多次傳代才能得到穩定的ES細胞系。
6.2條件培養基對ES細胞建系的影響(表3)6.2.1.血清對ES細胞增殖的影響 實驗時選用進口FBS，國產FBS和國產NCS。結果發現采用10％國產NBS+5％進口FBS時，ES細胞傳至第3代即消失，而10％國產NBS+5％國產FBS時，ES細胞可傳至第9代并呈增多趨勢，單純10％國產NBS也可見細胞傳至4代。因此，分離ES細胞時，篩選血清對成功克隆ES細胞是非常重要的。
表3各種血清條件培養基對ES細胞集落數的影響傳代數 0123456ES細胞培養基-24 158300ES細胞培養基-19 30000+5％進口FBSES細胞培養基-28 19 14 12 1621+5％國產FBS
6.2.2. 雞胚提取物對ES細胞集落數的影響在飼養層細胞存在的條件下，雞胚提取物對ES細胞集落數的影響見表4。
表4雞胚提取物對雞ES細胞集落數的影響傳代數0 12 3 4 5 6ES細胞培養基 - 36 28 15 8 1 0ES細胞培養基 - 31 19 14 18 21 41+雞胚提取物結果顯示在其它條件一致的情況下，加用雞胚提取物的培養液中，雞ES細胞集落數于5代后呈上升趨勢。
權利要求
1.一種穩定的促進生長發育和延緩衰老的雞胚營養素(chickenembryonin，CENIN)的制備方法，其特征是所述的制備方法，是選用健康禽類動物的孵化蛋胚胎組織，用任何機械方式搗碎→-20℃深凍→融解后攪拌均勻→加熱→恢復至室溫，-10℃凍存→融解后，離心→取上清液→過正壓截留柱→取濾液→除菌→分裝，包裝，制備注射藥/或加調味劑制作抗衰老口服液/或膠囊/或加賦型劑制造護膚品。
2.根據權利要求1所述的促進生長發育和延緩衰老的雞胚營養素的制備方法，其特征是加熱溫度可從40-95℃和時間從10-200min不等。
3.根據權利要求1所述的促進生長發育和延緩衰老的雞胚營養素的制備方法，其特征是截留柱的截止分子量為1000-1,000，000道爾頓。正壓0.1-1.0×104Pa，其組合方式為單柱或多柱組合使用。
4.根據權利要求1所述的促進生長發育和延緩衰老的雞胚營養素的制備方法，其特征是制備的雞胚營養素，截止分子量≤1,000,000道爾頓時，在制備過程到除菌一步時加入調味劑分裝成品可制成口服液/或膠囊和加入賦型劑可制作美容護膚品。
5.根據權利要求1所述的促進生長發育和延緩衰老的雞胚營養素的制備方法，其特征在于，將所制備的截止分子量≤20,000道爾頓時可制成注射液，或與其它藥物配伍靜脈滴入給藥。
6.根據權利要求1所述的雞胚營養素(CENIN)的制備方法，其特征是制備的雞胚營養素(CENIN)是一類具有促進細胞增殖、增強端粒酶活性和延緩衰老的分子量為1000-100,000的多肽或蛋白混合物。臨床上可用于治療老年性癡呆、少兒智力障礙和發育不良等疾病。
7.根據權利要求1所述的雞胚營養素(CENIN)的制備方法，其特征是制備的雞胚營養素(CENIN)，在體外能促進雞和小鼠的成纖維細胞和神經細胞的生長，以及雞胚胎干細胞的生長。
8.根據權利要求1所述的促進生長發育和延緩衰老的雞胚營養素(CENIN)的制備方法，其特征在于，選用健康禽類動物如雞、鴨、鴿、鵝等的孵化蛋胚胎組織，用任何機械方式搗碎→-20℃深凍→融解后攪拌均勻→70-90℃加熱15-30min→恢復至室溫，-10℃凍存→融解后，離心→取上清液→過0.1-1.0×104Pa正壓截留柱，截留柱的截止分子量為1000-1,000，000道爾頓→取濾液→除菌→分裝，包裝，制備注射藥/或加調味劑制作抗衰老口服液/或膠囊/或加賦型劑制造美容護膚品。
全文摘要
本發明涉及的是一種促進生長發育、煥發青春活力和延緩衰老的口服液、膠囊及護膚品的生產工藝和制備方法,它是一種從健康禽類動物孵化蛋胚胎組織中,在低溫條件下用生物化學技術提取,中空纖維超濾制備的具有促進正常細胞和干細胞生長,延緩細胞衰老的生物活性物質的方法。該方法提取的分子量為1萬和/1～20萬道爾頓的產物,和現有方法生產的產品相比,具有產量高、濃度高、活性高、成本低可滿足大規模生產和廣大人民群眾的健康保護需要,可用于改善少兒生長發育不良、煥發青年人的生命活力、治療老年性體弱癡呆和延緩衰老等作用。
文檔編號A61P3/02GK1342461SQ0011740
公開日2002年4月3日 申請日期2000年9月8日 優先權日2000年9月8日
發明者鄒清雁 申請人:鄒清雁