專利名稱：基因釋放型支架及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種醫療器械技術領域的支架及其制備方法，具體地說，是一種基因釋放型支架及其制備方法。
背景技術：
人體生理管道或管腔狹窄，尤其是血管和消化道腔道良、惡性狹窄或梗阻是臨床上常見的嚴重病癥。除了外科手術切除、放療和化療方法外，常用的介入治療手段主要有球囊擴張(主要對于良性狹窄)和支架置入。其中支架置入是相當重要的治療手段，能有效提高患者的生命質量，延長生存時間。臨床上的支架植入是基于介入手術，在人體內梗阻或狹窄的生理管路部位放置一根金屬或其他材料制成的管狀物，憑借支架的機械力來抵抗管壁組織的狹窄，使得病變管路重新開放，恢復其原有的生理功能。當前用于治療狹窄的支架主要有裸金屬支架、覆膜支架和藥物洗脫支架。其中藥物洗脫支架由于具有積極的治療作用，因此受到了廣泛的親睞和應用。藥物洗脫支架的優勢在于其在植入人體生理管路后除了能夠通過機械擴張力來使狹窄的生理管路重新開放之外，還能直接釋放化學藥物到病變的狹窄部位，達到積極治療疾病的作用。但目前幾乎所有藥物洗脫支架荷載和釋放的藥物均為小分子的化學藥物?；蛩幬锸切滦偷木哂袠O大應用前景的一類大分子藥物，其具備高效率的治療作用和可穩定遺傳的優點。一旦基因藥物進入目標靶細胞后，可以指導轉錄蛋白來治療疾病，或者使疾病基因沉默而不體現出疾病的性狀，或者修復病變的基因。除了常見的遺傳疾病外，許多其他臨床上多發性的常見疾病已經被證實與遺傳物質相關，如人類罹患的實體惡性腫瘤60%以上同基因突變有關。心血管領域的狹窄如冠狀動脈狹窄和其他局部疾病也被證實與遺傳物質突變有關，這些疾病以及生理管路良/惡性腫瘤都可以通過基因藥物來進行治療。因此，具有釋放基因藥物的支架具有極大的臨床優勢和廣闊的應用價值。經過對現有技術文獻的檢索發現
中國專利200610129600. 3本發明公開了一種載藥或載基因支架的制備方法，其先將支架表面進行預處理，包括濺射或電鍍金、固定高分子。然后將藥物或基因分子在支架表面固化。該發明在支架上穩定連接網狀大分子骨架，通過網狀分子共價連接糖類、肽類及抗體分子，通過網狀分子靜電吸附基因分子和轉染介導分子。其不足之處在于該支架的制備過程復雜，其利用巰基烷醇與藥物或基因的吸附來實現載藥，并采用乙醇溶液進行固定，其載藥量較低，且無法實現對基因釋放速率進行控制。中國專利200510080065. 2的發明專利公開了一種生物可降解性基因釋放血管內支架，由高分子支架材料和原癌基因c-myc的反義核苷酸序列制成，其中高分子材料選自聚乳酸、聚己內酯和L-乳酸/乙交酯共聚物中的兩種或三種；原癌基因c-myc的反義核苷酸序列為acgttgaggggcat。其不足之處在于該支架通過生物可降解的高分子材料來負載基因，其負載量很小；其所載的基因為裸基因，其進入目標細胞和在目標細胞中轉染效率很低。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種能荷載并控制釋放基因藥物的基因釋放型支架及其制備方法。本發明的支架通過先在其金屬表面經過吸附作用涂覆底物層，該底物層由多層的聚電解質組成，底物層的最表面帶正電荷，再利用基因帶負電荷這一性質，將基因通過靜電作用吸附在金屬表面。通過重復交替地吸附正/負電荷的生物可降解聚陽離子載體和基因，達到在金屬支架表面形成一定厚度的基因藥物層。本發明的基因釋放型支架在植入人體管腔后，能機械性地擴張梗阻或狹窄的管腔，同時其基因藥物層中的聚陽離子逐漸降解，造成基因層的瓦解，釋放出基因藥物層中包載的基因，在病變部位的目標靶細胞表達，達到局部治療管腔疾病的作用。本發明的目的是通過以下技術方案實現的
本發明涉及一種基因釋放型支架，由裸金屬支架、底物層和載基因涂層組成，底物層為兩層或兩層以上，由底物聚陰離子載體層和底物聚陽離子載體層交替組成；載基因涂層為兩層或兩層以上，由生物可降解聚陽離子載體層和基因層交替組成；以上各層之間以靜電吸引力相互結合。優選的，所述基因層由基因、基因復合物中的一種或兩種組成。優選的，所述基因復合物由基因與聚陽離子載體載體組成。優選的，所述聚陽離子基因載體為聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、聚賴氨酸、 聚精氨酸、殼聚糖、幾丁質、聚陽離子脂質、聚乙烯亞胺衍生物、聚乙烯胺衍生物、聚乙烯吡啶衍生物、聚賴氨酸衍生物、聚精氨酸衍生物、殼聚糖衍生物、幾丁質衍生物、聚陽離子脂質衍生物中的一種或幾種。優選的，所述基因為DNA、質粒DNA、小環DNA、RNA、SiRNA、寡聚核苷酸中的一種或幾種。優選的，所述底物聚陰離子載體為聚丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸、海藻酸、聚丙烯酰胺、透明質酸、聚磷酸、聚硅酸、聚丙烯酸衍生物、聚苯乙烯磺酸衍生化物、聚乙烯磺酸衍生物、聚乙烯磷酸衍生物、海藻酸衍生物、聚丙烯酰胺衍生物、透明質酸衍生物、聚磷酸衍生物、聚硅酸衍生物中的一種或幾種。優選的，所述底物聚陽離子載體為聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、殼聚糖、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸、幾丁質、聚組氨酸中的一種或幾種。優選的，所述生物可降解聚陽離子載體為聚胺酯、聚酰胺、聚磷酰胺、聚胺酯衍生物、聚酰胺衍生物、聚磷酰胺衍生物中的一種或幾種。本發明還涉及一種制備上述的基因釋放型支架的方法，包括以下步驟
(1)底物聚陰離子載體溶液的制備將底物聚陰離子載體溶解于氯化鈉溶液或PH3 10的緩沖液中，制得的溶液中聚陰離子載體的濃度為0. 01 μ g/mL 100mg/mL ；
(2)底物聚陽離子載體溶液的制備將底物聚陽離子載體溶解于氯化鈉溶液或pH3 10的緩沖液中，制得的溶液中底物聚陽離子載體濃度為0. 01 μ g/mL 100mg/mL ；
(3)生物可降解聚陽離子載體溶液制備將生物可降解聚陽離子載體溶解于pH2 7 的緩沖液中，制得的溶液中生物可降解聚陽離子載體的濃度在0. 01 μ g/mL 300mg/mL之
5間；
(4)基因溶液的制備將基因溶解于pH1 10的緩沖液中，制得的溶液中基因濃度在 Ο.ΟΙμ g/mL 500mg/mL之間，或繼續加入相對于基因質量0 1000倍量的聚陽離子載體， 漩渦混合均勻；
(5)將裸金屬支架在步驟(1)的底物聚陰離子載體溶液中浸漬0.1 30分鐘，取出用去離子水或緩沖液漂洗0. 1 30分鐘，置于步驟(2)的底物聚陽離子載體溶液中浸漬0. 1 30分鐘，取出再用去離子水或緩沖液漂洗0. 1 30分鐘；
(6 )重復步驟(5 )0 50次，重新置于步驟(1)的底物聚陰離子載體溶液中浸漬0. 1 30分鐘，取出后再用去離子水或醋酸鈉緩沖液漂洗0. 1 30分鐘，制得含有底物層的金屬支架；
(7)將步驟(6)中制得的含有底物層的金屬支架置于步驟(3)的生物可降解聚陽離子載體溶液中浸漬0. 1 30分鐘，取出用去離子水或緩沖液漂洗0. 1 30分鐘，置于步驟(4) 的基因溶液中浸漬0. 1 30分鐘，取出再用去離子水或醋酸鈉緩沖液漂洗0. 1 30分鐘；
(8)重復步驟(7)0 1000次，將支架取出在氮氣流下常溫干燥至少72小時，即得基因釋放型支架。與現有技術相比，本發明具有的有益效果為
1、與現有支架相比，基因釋放型支架在通過機械力擴張狹窄腔道的同時，能釋放抗基因藥物，達到高效治療疾病的作用。2、本發明的基因釋放型支架通過控制基因涂層中生物可降解聚陽離子載體的降解速率來控制基因的釋放速度，具有良好的可控性。3、選擇合適的生物可降解聚陽離子載體作為基因層的載體還可以實現刺激響應性釋放基因藥物，也即實現快速釋放。4、本發明的制備方法采用溶液浸漬法，操作簡單，穩定可控，適合于規模化生產。


圖1是本發明的基因釋放型支架的表面結構示意圖2為本發明的基因釋放型支架的基因藥物釋放過程示意圖； 其中，1、裸金屬支架，2、底物層，3、載基因涂層，4、底物聚陰離子載體層，5、底物聚陽離子載體層，6、生物可降解聚陽離子載體層，7、基因層。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的實施例做詳細的說明實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍并不限于下述的實施例。實施例1
如圖1、2所示，本發明由裸金屬支架1、底物層2和載基因涂層3組成，底物層2由2層底物聚陰離子載體層4 (聚丙烯酸層)和1層底物聚陽離子載體層5 (聚乙烯亞胺層)交替組成，載基因涂層3由3層生物可降解聚陽離子載體6 (聚胺酯)和3層基因層7 (質粒DNA 層)交替組成，以上各層之間以靜電吸引力相互結合。
制備方法包括以下步驟
(1)聚丙烯酸溶液的制備將聚丙烯酸溶解于氯化鈉溶液中，制得的溶液中聚丙烯酸的濃度為^g/mL ；
(2)聚乙烯亞胺溶液的制備將聚乙烯亞胺溶解于氯化鈉溶液中，制得的溶液中聚乙烯亞胺濃度為lmg/mL ；
(3)聚胺酯溶液制備將聚胺酯溶解于pH5的醋酸鈉緩沖液中，制得的溶液中聚胺酯的濃度為lmg/mL ；
(4)基因溶液的制備將基因溶解于pH7的醋酸鈉緩沖液中，制得的溶液中基因濃度為 100 μg/mL ；
(5)將裸金屬支架在步驟(1)的聚丙烯酸溶液中浸漬5分鐘，取出用去離子水漂洗5分鐘，置于步驟(2)的聚乙烯亞胺溶液中浸漬5分鐘，取出再用去離子水漂洗5分鐘；
(6)重復步驟(5)1次，重新置于步驟(1)的聚丙烯酸溶液中浸漬5分鐘，取出后再用去離子水漂洗5分鐘，制得含有底物層的金屬支架；
(7)將步驟(6)中制得的含有底物層的金屬支架置于步驟(3)的聚胺酯溶液中浸漬5 分鐘，取出用醋酸鈉緩沖液漂洗5分鐘，置于步驟(4)的基因溶液中浸漬5分鐘，取出再用去離子水或醋酸鈉緩沖液漂洗5分鐘；
(8)重復步驟(7X3次，將支架取出在氮氣流下常溫干燥72小時，即得基因釋放型支架。實施例2
如圖1、2所示，本發明由裸金屬支架1、底物層2和載基因涂層3組成，底物層2由16 層底物聚陰離子載體層4 (聚苯乙烯磺酸層)和15層底物聚陽離子載體層5 (聚乙烯亞胺層)交替組成，載基因涂層3由20層生物可降解聚陽離子載體層6 (聚胺酯)和20層基因層7交替組成，以上各層之間以靜電吸引力相互結合，基因層由基因和基因復合物共同組成，基因復合物由基因(DNA)與聚陽離子脂質組成。制備方法包括以下步驟
(1)聚苯乙烯磺酸溶液的制備將聚苯乙烯磺酸溶解于氯化鈉溶液中，制得的溶液中聚苯乙烯磺酸的濃度為1. 5mg/mL ；
(2)聚賴氨酸溶液的制備將聚賴氨酸溶解于氯化鈉溶液中，制得的溶液中聚賴氨酸濃度為 1. 5mg/mL ；
(3)聚胺酯溶液制備將聚胺酯溶解于pH5. 5的醋酸鈉緩沖液中，制得的溶液中聚胺酯的濃度為ang/mL ；
(4)基因溶液的制備將基因溶解于pH7. 2的醋酸鈉緩沖液中，制得的溶液中基因濃度為100 μ g/mL，繼續加入相對于基因質量100倍量的聚陽離子脂質，漩渦混合均勻；
(5)將裸金屬支架在步驟(1)的聚苯乙烯磺酸溶液中浸漬5分鐘，取出用去離子水漂洗 5分鐘，置于步驟(2)的聚賴氨酸溶液中浸漬5分鐘，取出再用去離子水漂洗5分鐘；
(6)重復步驟(5)15次，重新置于步驟(1)的聚苯乙烯磺酸溶液中浸漬5分鐘，取出后再用去離子水漂洗5分鐘，制得含有底物層的金屬支架；
(7)將步驟(6)中制得的含有底物層的金屬支架置于步驟(3)的聚胺酯溶液中浸漬5 分鐘，取出用醋酸鈉緩沖液漂洗5分鐘，置于步驟(4)的基因溶液中浸漬5分鐘，取出再用去離子水或醋酸鈉緩沖液漂洗5分鐘；(8)重復步驟(7) 20次，將支架取出在氮氣流下常溫干燥94小時，即得基因釋放型支
^K O實施例3
如圖1、2所示，本發明由裸金屬支架1、底物層2和載基因涂層3組成，底物層2由1層底物聚陰離子載體層4 (聚丙烯酰胺和聚乙烯磷酸的混合層)和1層底物聚陽離子載體層5 (幾丁質和聚精氨酸的混合層)交替組成，載基因涂層3由1層生物可降解聚陽離子載體層 6 (聚磷酰胺)和1層基因層7交替組成，以上各層之間以靜電吸引力相互結合，基因層由基因和基因復合物共同組成，基因復合物由基因(SiRNA)與聚乙烯胺以及聚乙烯吡啶組成。制備方法包括以下步驟
(1)聚丙烯酰胺和聚乙烯磷酸的混合溶液的制備將聚丙烯酰胺和聚乙烯磷酸溶解于 PH3的醋酸鈉緩沖液溶液中，制得的溶液中聚丙烯酰胺和聚乙烯磷酸的濃度為lOOmg/mL ；
(2)幾丁質和聚精氨酸混合溶液的制備將幾丁質和聚精氨酸溶解于pH3的醋酸鈉緩沖液溶液中，制得的溶液中幾丁質和聚精氨酸濃度為lOOmg/mL ；
(3)聚磷酰胺溶液制備將聚磷酰胺溶解于pH2的醋酸鈉緩沖液中，制得的溶液中聚胺酯的濃度為300mg/mL ；
(4)基因溶液的制備將基因(SiRNA)溶解于pH1的醋酸鈉緩沖液中，制得的溶液中基因濃度為500mg/mL，繼續加入相對于基因質量1000倍量的聚乙烯胺和聚乙烯吡啶，漩渦混合均勻；
(5)將裸金屬支架在步驟(1)的聚丙烯酰胺和聚乙烯磷酸的混合溶液中浸漬30分鐘， 取出用去離子水漂洗5分鐘，置于步驟(2)的幾丁質和聚精氨酸混合溶液中浸漬30分鐘， 取出再用去離子水漂洗5分鐘；制得含有底物層的金屬支架；
(6)將步驟(5)中制得的含有底物層的金屬支架置于步驟(3)的聚磷酰胺溶液中浸漬 30分鐘，取出用醋酸鈉緩沖液漂洗5分鐘，置于步驟(4)的基因溶液中浸漬30分鐘，取出再用去離子水或醋酸鈉緩沖液漂洗5分鐘；
(7)將支架取出在氮氣流下常溫干燥94小時，即得基因釋放型支架。實施例4
如圖1、2所示，本發明由裸金屬支架1、底物層2和載基因涂層3組成，底物層2由51 層底物聚陰離子載體層4 (透明質酸的衍生物層)和50層底物聚陽離子載體層5 (聚乙烯吡啶層)交替組成，載基因涂層3由1000層生物可降解聚陽離子載體層6 (聚酰胺的衍生物) 和1000層基因層7交替組成，以上各層之間以靜電吸引力相互結合，基因層由基因和基因復合物共同組成，基因復合物由基因(寡聚核苷酸)與聚精氨酸的衍生物組成。制備方法包括以下步驟
(1)透明質酸的衍生物溶液的制備將透明質酸的衍生物溶解于PHlO的磷酸鹽緩沖液中，制得的溶液中透明質酸的衍生物的濃度為0. Olyg/mL ；
(2)聚乙烯吡啶溶液的制備將聚乙烯吡啶溶解于pHIO的磷酸鹽緩沖液中，制得的溶液中聚乙烯吡啶濃度為0. 01 μ g/mL ；
(3)聚酰胺的衍生物溶液制備將聚酰胺的衍生物溶解于pH7的醋酸鈉緩沖液中，制得的溶液中聚酰胺的衍生物的濃度為0. 01 y g/mL ；
(4)基因溶液的制備將基因(寡聚核苷酸)溶解于pH10的醋酸鈉緩沖液中，制得的溶液中基因濃度為0. 01 μ g/mL，繼續加入相對于基因質量10倍量的聚精氨酸的衍生物，漩渦混合均勻；
(5)將裸金屬支架在步驟(1)的透明質酸的衍生物溶液中浸漬0.1分鐘，取出用去離子水漂洗5分鐘，置于步驟(2)的聚乙烯吡啶溶液中浸漬0. 1分鐘，取出再用去離子水漂洗5 分鐘；
(6)重復步驟(5)50次，重新置于步驟(1)的透明質酸的衍生物溶液中浸漬0. 1分鐘， 取出后再用去離子水漂洗5分鐘，制得含有底物層的金屬支架；
(7)將步驟(6)中制得的含有底物層的金屬支架置于步驟(3)的聚酰胺的衍生物溶液中浸漬0. 1分鐘，取出用醋酸鈉緩沖液漂洗5分鐘，置于步驟(4)的基因溶液中浸漬0. 1分鐘，取出再用去離子水或醋酸鈉緩沖液漂洗5分鐘；
(8)重復步驟(7)1000次，將支架取出在氮氣流下常溫干燥94小時，即得基因釋放型支架。
權利要求
1.一種基因釋放型支架，由裸金屬支架、底物層和載基因涂層組成，其特征在于，底物層為兩層或兩層以上，由底物聚陰離子載體層和底物聚陽離子載體層交替組成；載基因涂層為兩層或兩層以上，由生物可降解聚陽離子載體層和基因層交替組成；以上各層之間以靜電吸引力相互結合。
2.根據權利要求1所述的基因釋放型支架，其特征在于，所述基因層由基因、基因復合物中的一種或兩種組成。
3.根據權利要求2所述的基因釋放型支架，其特征在于，所述基因復合物由基因與聚陽離子載體組成。
4.根據權利要求3所述的基因釋放型支架，其特征在于，所述聚陽離子基因載體為聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、聚賴氨酸、聚精氨酸、殼聚糖、幾丁質、聚陽離子脂質、聚乙烯亞胺衍生物、聚乙烯胺衍生物、聚乙烯吡啶衍生物、聚賴氨酸衍生物、聚精氨酸衍生物、 殼聚糖衍生物、幾丁質衍生物、聚陽離子脂質衍生物中的一種或幾種。
5.根據權利要求2 4中任一項所述的基因釋放型支架，其特征在于，所述基因為 DNA、質粒DNA、小環DNA、RNA、SiRNA、寡聚核苷酸中的一種或幾種。
6.根據權利要求1所述的基因釋放型支架，其特征在于，所述底物聚陰離子載體為聚丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸、海藻酸、聚丙烯酰胺、透明質酸、聚磷酸、 聚硅酸、聚丙烯酸衍生物、聚苯乙烯磺酸衍生化物、聚乙烯磺酸衍生物、聚乙烯磷酸衍生物、 海藻酸衍生物、聚丙烯酰胺衍生物、透明質酸衍生物、聚磷酸衍生物、聚硅酸衍生物中的一種或幾種。
7.根據權利要求1所述的基因釋放型支架，其特征在于，所述底物聚陽離子載體為聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、殼聚糖、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸、幾丁質、聚組氨酸中的一種或幾種。
8.根據權利要求1所述的基因釋放型支架，其特征在于，所述生物可降解聚陽離子載體為聚胺酯、聚酰胺、聚磷酰胺、聚胺酯衍生物、聚酰胺衍生物、聚磷酰胺衍生物中的一種或幾種。
9.一種制備如權利要求1所述的基因釋放型支架的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)底物聚陰離子載體溶液的制備將底物聚陰離子載體溶解于氯化鈉溶液或PH3 10的緩沖液中，制得的溶液中聚陰離子載體的濃度為0. 01 μ g/mL 100mg/mL ；(2)底物聚陽離子載體溶液的制備將底物聚陽離子載體溶解于氯化鈉溶液或pH3 10的緩沖液中，制得的溶液中底物聚陽離子載體濃度為0. 01 μ g/mL 100mg/mL ；(3)生物可降解聚陽離子載體溶液制備將生物可降解聚陽離子載體溶解于pH2 7 的緩沖液中，制得的溶液中生物可降解聚陽離子載體的濃度在0. 01 μ g/mL 300mg/mL之間；(4)基因溶液的制備將基因溶解于pH1 10的緩沖液中，制得的溶液中基因濃度在 Ο.ΟΙμ g/mL 500mg/mL之間，或繼續加入相對于基因質量0 1000倍量的聚陽離子載體， 漩渦混合均勻；(5)將裸金屬支架在步驟(1)的底物聚陰離子載體溶液中浸漬0.1 30分鐘，取出用去離子水或緩沖液漂洗0. 1 30分鐘，置于步驟(2)的底物聚陽離子載體溶液中浸漬0. 1 30分鐘，取出再用去離子水或緩沖液漂洗0. 1 30分鐘；(6 )重復步驟(5 )0 50次，重新置于步驟(1)的底物聚陰離子載體溶液中浸漬0. 1 30分鐘，取出后再用去離子水或醋酸鈉緩沖液漂洗0. 1 30分鐘，制得含有底物層的金屬支架；(7)將步驟(6)中制得的含有底物層的金屬支架置于步驟(3)的生物可降解聚陽離子載體溶液中浸漬0. 1 30分鐘，取出用去離子水或緩沖液漂洗0. 1 30分鐘，置于步驟(4) 的基因溶液中浸漬0. 1 30分鐘，取出再用去離子水或醋酸鈉緩沖液漂洗0. 1 30分鐘；(8)重復步驟(7)0 1000次，將支架取出在氮氣流下常溫干燥至少72小時，即得基因釋放型支架。
全文摘要
本發明涉及一種基因釋放型支架及其制備方法。該支架由裸金屬支架、底物層和載基因涂層組成，底物層由兩層或兩層以上的底物聚陰離子載體層和聚陽離子載體層交替組成，載基因涂層由兩層或兩層以上的生物可降解聚陽離子載體層和基因層交替組成，各層之間以靜電吸引力相互結合。其制備方法采用溶液浸漬法，通過重復交替地將金屬支架浸漬在聚陽離子載體溶液和基因溶液中，實現在支架表面交替涂覆載體層和基因層。本發明的支架用于荷載一切帶負電荷的基因(包括DNA和RNA)，實現緩釋或速釋基因藥物；在植入人體后，其不僅能機械性地擴張狹窄管路，還能向病變管壁組織方向釋放治療基因藥物，用于治療人體生理管路的良性或惡性狹窄疾病。
文檔編號A61L31/10GK102441192SQ20111029298
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者沈園園, 榮浩鈞, 郭圣榮, 陳偉巒, 雷磊 申請人:上海交通大學