專利名稱：牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法。
背景技術：
淋巴囊腫病(Lymphocystis disease，LCD)是困擾水產養殖業多年無法解決的難題之一。其病原體，淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus LCDV)可感染包括牙鲆在內的100余種海淡水魚類。就牙鲆而言，感染LCDV的病魚在體表產生大量的瘤狀物，嚴重影響其經濟價值，同時該病還可導致養殖牙鲆高達60-70％的死亡率。由于牙鲆是我國海水養殖的主要經濟品種，而淋巴囊腫病又具有高流行性的特點，對養殖業造成的經濟損失十分巨大。因此，迫切需要有效的藥物或疫苗加以防治。
疫苗已被證明是最有效的疾病防治手段之一。經過不斷的發展，第三代的亞單位(多肽)疫苗和第四代的核酸疫苗正在逐步替代傳統的滅活和減毒疫苗成為疫苗研發的重點。亞單位疫苗目前已在人類的衛生健康體系中得到應用，包括乙肝、流感等病毒性疾病的防治。亞單位疫苗的特點在于安全性好，能有效地誘導機體CD4+T細胞通過Th1途徑激活漿細胞的分化與增殖，從而提高體液免疫應答水平。
亞單位疫苗研制的核心在于抗原蛋白的亞單位結構必須保持原有的免疫原性和免疫反應性。已知結構與功能的抗原蛋白數量微乎其微，占據絕大多數的未知抗原蛋白嚴重制約了亞單位疫苗的研究與開發進度，這是因為蛋白質的分離、純化和結構功能分析在生命科學已取得巨大突破的今天仍然是一個技術難題，需要耗費大量的時間和人力物力才能解決。相反地，基因/基因組克隆、測序技術的飛速發展為反向的蛋白質功能、結構分析提供了有力的輔助手段。隨著海量的核酸數據庫以幾何級數形式不斷地增長，生物信息學作為挖掘序列蘊含信息強有力的工具也應運而生，并正處于高速發展過程中。
本發明利用生物信息學技術推定產生的模擬表位，依據它們的氨基酸序列合成相應模擬表位的多肽，經過與載體的偶聯制備出特異性針對牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗。

發明內容
本發明的目的是憑借已有的LCDV-cn保護性抗原核衣殼蛋白和囊膜蛋白的三個模擬表位，構建特異性針對牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。
本發明的牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法是，利用對已知的淋巴囊腫病毒歐洲分離株(LCDV-1)基因組序列所進行的生物信息學分析而得到牙鲆LCDV-cn(淋巴囊腫病毒中國分離株)核衣殼蛋白和囊膜蛋白的3個模擬表位，然后依據模擬表位的氨基酸序列，合成得到相應的3種多肽，經過與蛋白質載體的偶聯與純化，即制備了牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。進而通過養殖牙鲆的動物實驗，驗證了多肽疫苗的特異性和保護性。
上述的3個模擬表位序列分別為(文中的氨基酸簡稱均采用IUPAC標準)29ATKNNMSRTSETDNN，即NH2-Thr-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Arg-Thr-Ser-Glu-Thr-Asp-Asn-Asn-COOH29BCKKNSDSTDC，即NH2-Cys-Lys-Lys-Asn-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-COOHTK3TNEERRLMGT，即NH2-Thr-Asn-Glu-Glu-Arg-Arg-Leu-Met-Gly-Thr-COOH采用的蛋白質載體為鑰孔槭血藍蛋白(簡稱為KLH)，也可采用血紅蛋白、小牛血清白蛋白等。
本發明所依據的原理如下其一，LCDV-1與LCDV-cn同屬虹彩病毒科、淋巴囊腫病毒屬，在親緣關系上具有較高的同源性(已知兩種病毒的核衣殼蛋白基因MCP在核酸序列上的同源性為77％)，因此適于進行核酸序列的比較、分析。同時，由于兩種病毒侵染的宿主與組織、細胞類似、引起的病理反應和癥狀也完全相同，兩種病毒產生的受體反應與血清免疫反應也是相似的，據此可以推定，兩種病毒間存在一致的保護性抗原。鑒于LCDV-1的基因組序列已被測定，利用LCDV-1的基因組序列推斷LCDV-cn的保護性抗原及其抗原決定簇因此成為可能。
其二，抗原決定簇(或稱表位)是保護性抗原誘導機體產生適應性免疫應答的關鍵。MHC I、II分子與表位形成的復合體分別為TC和TH所識別，引起細胞因子的分泌、B、T細胞的活化、增殖與分化，最終產生相應的體液和細胞免疫應答。因此，利用表位直接構建多肽疫苗能夠誘導機體產生特異性免疫反應。
具體實施例方式
本方法利用經生物信息學分析得到的牙鲆LCDV-cn保護性抗原模擬表位，合成得到與模擬表位序列相一致的多肽，經過與載體蛋白質的偶聯和純化，制備出牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。具體方法如下
首先選擇出牙鲆LCDV-cn保護性抗原模擬表位通過對已知基因組序列的LCDV-1所進行的生物信息學分析，篩選得到LCDV-cn兩種保護性抗原核衣殼蛋白和囊膜蛋白的3條模擬表位，即TK3、29A和29B。同時，為了識別不同抗原提呈途徑對多肽疫苗可能產生的影響，以及模擬表位多肽疫苗的特異性，分別選取了上述兩種保護性抗原模擬表位的參照序列(TK1)和對照序列(TK2、29C)共三條。選取的的模擬表位與參照和對照序列的說明列于下表

然后制備模擬表位多肽疫苗依據上表中所列的全部模擬表位序列和對照與參照序列，通過固相合成法制得了相應的合成多肽6條，即TK1、TK2、TK3與29A、29B和29C，用質譜分析鑒定了合成多肽序列的一致性。
合成多肽通過與載體連接制備得到模擬表位的多肽疫苗，具體方法如下合成多肽與KLH(鑰孔槭血藍蛋白)用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.2)溶解，濃度均為2mg/ml，等體積混合，逐滴加入等體積的戊二醛(0.25％)，在室溫下混勻至少6hr，再用含50mM甘氨酸的PBS對連接產物透析純化過夜，所得純化產物即為模擬表位多肽疫苗。
以下，對本發明獲得的3種模擬表位多肽疫苗的誘導牙鲆產生細胞和體液免疫應答的效應進行了檢測，實驗驗證如下對純化的牙鲆LCDV-cn模擬表位多肽疫苗進行了動物實驗，以鑒定疫苗的特異性和免疫效應。實驗隨機選取養殖牙鲆共56條，體重約為250-300g。分為8組，實驗組共6組，6種待測多肽疫苗(含參照和對照疫苗，如上表所示)各為8條牙鲆一組。對照設2組，分為每組4條，分別用PBS和等量KLH取代多肽疫苗進行注射。
偶聯的多肽疫苗以2mg/ml的濃度每條魚背部肌肉注射200μl，10天后同樣劑量注射進行二次免疫。26天后用純化的20mg/ml LCDV-cn 200μl/條攻毒28條牙鲆(每組牙鲆取半數，實驗組每組4條，對照組每組2條)。56、76天后分別取部分牙鲆輕度麻醉，解剖取鰓、心、頭腎、脾四種組織分別用Davidson固定液固定或于RPMI 1640細胞培養液中保存備用。
采血方式為尾部靜脈采血，每條魚0.5ml/次，4℃保存過夜，10000g離心10分鐘，收集上清作為牙鲆抗血清。采血時間(初次免疫日期計為d0，即第0天)分別為d-2，d3，d8，d18，d27，d38，d56，d76。
免疫效應評價方法為了檢測牙鲆LCDV-cn模擬表位多肽疫苗的免疫效應，分別采用了ELISA(酶聯免疫吸附分析法)用于牙鲆抗LCDV-cn IgM的表達水平變化及其特異性檢測，MTT法檢測細胞因子的表達及淋巴細胞的增殖，免疫組化和免疫印跡用于病毒感染狀況與相對保護率的檢測。
免疫組化和免疫印跡分析結果表明，攻毒的對照組(KLH、PBS)在鰓、腎組織均產生陽性反應(一抗為兔抗LCDV-cn多抗，效價1∶4000)，而實驗組的29B、29A為陰性，TK1/2/3、29C則顯示為弱陽性，按照陰性至陽性的遞增次序，6種疫苗和對照的結果為29B＜29A＜TK3＜TK1＜TK2＜29C＜KLH＜PBS，相對保護率(四個區域著色點的平均值)依次為96.4％、91.2％、83％、44％、11％、8％、3％，0％。這一結果說明，本發明的模擬表位多肽疫苗(29A、29B和TK3)具有明顯的免疫保護作用，同時也說明它們是特異性針對LCDV-cn的疫苗，而非模擬表位序列的對照疫苗基本不具備保護作用。
細胞因子的檢測結果表明，攻毒后牙鲆分離出的脾、頭腎淋巴細胞經MTT檢驗，細胞因子的表達水平與淋巴細胞的增殖在實驗組的29B、A中最高，分別為0.445±0.067和0.395±0.059(均為OD570-OD630所得值，下同)，甚至高于PHA刺激的陽性對照(0.267±0.081)，其余依次為TK3(0.227±0.051)、TK1(0.098±0.043)、TK2(0.046±0.038)和29C(0.024±0.030)，對照組分別為KLH(0.040+0.037)、PBS(0.018±0.017)。概括起來，依照陽性遞減的次序，其結果為29B＞29A＞PHA＞TK3＞TK1＞KLH＞29C＞PBS。由此結果可以看出，經過多肽的刺激，免疫后的牙鲆淋巴細胞能夠特異性地識別抗原并產生強烈的細胞增殖反應并提高細胞因子的表達水平，而淋巴細胞基本不能將對照疫苗作為特異性抗原加以識別，其增殖與表達水平僅與非特異性的KLH相當。
抗體水平的檢測結果如下(下述均為OD495光密度值)，免疫前的牙鲆體內檢測不到抗LCDV-cn的抗體存在，抗體水平也較低，各組的平均值分別為0.053±0.037(病毒包被，二抗采用兔抗牙鲆IgM的多抗，效價1∶2000)和0.107±0.087(牙鲆抗血清包被，總蛋白50μg/ml，二抗為兔抗牙鲆IgM的多抗，效價1∶2000)。免疫后第8天的抗體水平(除PBS對照組外0.062±0.044)具有提高，平均為0.207±0.112。但是，其中僅有29A、29B免疫牙鲆所產生的抗體具有中和LCDV-cn活性，其特異性抗體表達水平分別為0.097+0.043和0.112±0.047(病毒包被)，其余實驗組(包括KLH對照組)均產生各自免疫原的抗體，各組平均為0.107±0.085(實驗組多肽包被，對照組KLH包被)。
第18天(二次免疫后8天)和第38天(攻毒后3天)出現兩次高峰，兩次的抗體水平分別為0.479±0.102(實驗組+KLH對照組平均值)和0.761±0.243(攻毒組平均值)。其中，只有29A和29B產生特異性抗體，分別為0.385±0.079/0.789±0.153與0.482±0.094/0.906±0.183(29A、29B的第18/38天抗體檢測值)。此后，29A、29B攻毒組的抗體水平急劇下降，至d76降至0.142±0.056，其余各組則基本維持在較穩定的水平，約為0.351±0.120，并且在攻毒組中(除29A、29B外)，在d56、d76均能檢測到牙鲆抗LCDV-cn的抗體，其均值為0.122±0.063。
上述抗體檢測結果表明，模擬表位多肽疫苗29A和29B能夠誘導B細胞的增殖、分化，產生特異性的體液免疫應答，并引起免疫記憶效應，從而有效提高牙鲆對LCDV-cn的免疫預防能力。
因此，本發明制得的3種模擬表位多肽疫苗的免疫效應檢測結果呈現出高度的一致，說明本發明采用的生物信息學設計的模擬表位具有強免疫原性和免疫反應性，并據此構建出的多肽疫苗能夠誘導牙鲆產生特異性的體液和細胞免疫應答，同時也可提供較高的相對保護率。此外，模擬表位多肽疫苗與對照疫苗免疫效應的對比結果還證明，本發明的模擬表位與LCDV-cn保護性抗原核衣殼蛋白和囊膜蛋白的抗原決定簇是一致的。基于上述，本發明中的三種模擬表位多肽疫苗(29A、29B和TK3)能夠起到有效的免疫預防與保護作用。
本方法制備簡便。與滅活疫苗不完善的免疫作用不同，模擬表位多肽疫苗能夠有效誘導機體產生全面的細胞和體液免疫應答；而與減毒疫苗相比，多肽疫苗又具有很高的安全性，因此，本方法制備的疫苗能夠作為綜合了傳統減毒、滅活疫苗的優勢而產生的替代品。
權利要求
1.牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，首先對已知的淋巴囊腫病毒歐洲分離株基因組序列所進行的生物信息學分析而得到牙鲆淋巴囊腫病毒中國分離株核衣殼蛋白和囊膜蛋白的3個模擬表位，然后依據模擬表位的氨基酸序列，合成得到相應的3種多肽，經過與蛋白質載體的偶聯與純化，即制備了牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。
2.如權利要求1所述的牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，其特征在于上述的3個模擬表位序列分別為29ANH2-Thr-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Arg-Thr-Ser-Glu-Thr-Asp-Asn-Asn-COOH29BNH2-Cys-Lys-Lys-Asn-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-COOHTK3NH2-Thr-Asn-Glu-Glu-Arg-Arg-Leu-Met-Gly-Thr-COOH。
3.如權利要求1所述的牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，其特征在于所述的蛋白質載體為鑰孔槭血藍蛋白。
4.如權利要求1所述的牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，其特征在于所述的蛋白質載體為血紅蛋白、小牛血清白蛋白。
全文摘要
一種牙鲆淋巴囊腫病的多肽疫苗的制備方法，首先對已知的淋巴囊腫病毒歐洲分離株基因組序列所進行的生物信息學分析而得到牙鲆淋巴囊腫病毒中國分離株核衣殼蛋白和囊膜蛋白的3個模擬表位，然后依據模擬表位的氨基酸序列，合成得到相應的3種多肽，經過與蛋白質載體的偶聯與純化，即制備了牙鲆淋巴囊腫病的模擬表位多肽疫苗。本方法制備簡便、疫苗能夠有效誘導產生全面的細胞和體液免疫應答，還具有很高的安全性。上述的3個模擬表位序列分別為TKNNMSRTSETDN、CKKNSDSTD和TNEERRLMGT。采用的蛋白質載體為鑰孔槭血藍蛋白，也可采用血紅蛋白、小牛血清白蛋白等。
文檔編號A61P31/12GK1785425SQ20051010431
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月18日 優先權日2005年10月18日
發明者吳謖琦, 孫修勤, 張進興, 鄭鳳榮, 洪旭光, 曲凌云 申請人:國家海洋局第一海洋研究所