專利名稱：碳酰肼的藥物用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及吡唑酰腙衍生物在抑制血管內皮細胞衰老和凋亡中的應用；尤其涉及 (E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內皮細胞衰老和凋亡藥物中的應用。
背景技術：
(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼結構式如下分子式=C24H2tlClN5O3分子量461.90性狀黃色固體。目前，有關吡唑酰腙衍生物鮮有報道，尤其未見(E)-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在血管內皮細胞衰老及凋亡方面的作用以及相關的藥理學的研究與應用的報道。針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內皮細胞衰老和凋亡藥物中的應用。本發明所述的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內皮細胞衰老和凋亡藥物中的應用；其中 能有效抑制凋亡、核片段化和DNA凝縮的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼的濃度是40 80mg/L。本發明的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在抑制血管內皮細胞衰老和凋亡中具有明顯作用，為新型心血管藥物的開發提供了誘人前景。為了更好地理解本發明的實質及本發明所述化合物的作用效果，下面結合
發明內容(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼的藥理實驗及結果，來進一步闡述其在抑制血管內皮細胞衰老和凋亡中的作用。血管內皮細胞的制備以常規方法培養血管內皮細胞，選取生長狀態良好的、且處于對數生長期的血管內皮細胞，備用。觀察(E)-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼對抑制去除血清和生長因子的血管內皮細胞衰老和凋亡的影響。1、顯微鏡觀察細胞形態學變化將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養液培養；對照組細胞去處血清和生長因子培養；處理組是將血管內皮細胞去除血清和生長因子后，分別加(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1- (3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼，處理M小時和48小時。然后，光鏡下直接觀察血管內皮細胞凋亡的形態學變化和凋亡小體的形成。結果發現(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1- (3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理血管內皮細胞M和48小時，較之對照組可明顯抑制凋亡小體的形成以及凋亡的形態學變化(見圖1)。2、熒光顯微鏡觀察細胞核凝縮及核碎裂情況將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養液培養；對照組細胞去處血清和生長因子培養；處理組是將血管內皮細胞去除血清和生長因子后，加(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小時。 然后對各組進行AO染色，在熒光顯微鏡下觀察血管內皮細胞凋亡時，細胞核DNA的凝縮及核碎裂情況。結果顯示處理組中細胞核DNA凝縮及碎裂較對照組減少(見圖2)。3、用MTT法檢測細胞琥珀酸脫氫酶的活性，以判斷血管內皮細胞生長情況將血管內皮細胞接種于96孔培養板中，經不同濃度(40，60，80 μ g/ml) (E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理后，在M小時和48小時分別用MTT法測琥珀酸脫氫酶活性，計算存活率，存活細胞％ =(處理組OD值/對照組OD值)X 100% (以不含細胞的培養液為空白組調零)。結果表明處理組細胞存活率較對照組顯著升高且呈劑量依賴性。(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼對細胞生長的影響結果見下表藥物(|J g/ml) M小時細胞存活率(％)48小時細胞存活率(％)
對照組 54. 7±3. 1046. 89±5. 46
DMSO 組 54. 60 土 3. 5045. 16 土 5. 26 藥物處理組
40 66. 79±4. 7352. 12±3. 22 60 72. 46±5. 5263. 32±6. 43 _80_75. 72±4. 14 _ 65. 71±2. 57_4、Tunel染色標記凋亡細胞將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養液培養；對照組細胞去處血清和 生長因子培養；處理組是將血管內皮細胞去除血清和生長因子后，加 )-N-(2-羥基苯亞 甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小吋。 然后，用福爾馬林固定25分鐘，0.2% Triton X-100處理5分鐘，每孔加入50 yl rTdr孵 育液，37°C下孵育1小吋，SSC終止反應，檢測標記凋亡細胞。分別計數正常組細胞、對照組 細胞、處理組細胞，計算其陽性率。結果顯示(見圖3):正常組細胞，用含有血清和生長因子的M199培養液培養M小時幾乎無陽性細 胞；對照組細胞，去除血清和生長因子M小吋，陽性細胞較多；處理組細胞，用￠) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧 基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小吋，陽性細胞較對照組顯著降低。提示⑶-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3バ4_甲氧基苯 基)-IH-吡唑-5-碳酰胼可抑制血管內皮細胞凋亡。5、衰老相關的0 -半乳糖苷酶染色，以判斷細胞衰老情況將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養液培養；對照組細胞去處血清和 生長因子培養；處理組是將血管內皮細胞去除血清和生長因子后，加 )-N-(2-羥基苯亞 甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小吋。 然后，用￠-半乳糖染液染色后觀察。隨機選取正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞中的 各10個視野，計數細胞總數和陽性細胞數，計算陽性率。結果顯示(見圖4):正常組細胞，含有血清和生長因子的M199培養液培養M小吋，陽性率較低；對照組細胞，去處血清和生長因子陽性率較正常細胞組陽性率上升；處理組細胞，去處血清和生長因子用-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡 啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小吋，陽性率下降。提示⑶-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3バ4_甲氧基苯 基)-IH-吡唑-5-碳酰胼降低了陽性細胞比率，能抑制血管內皮細胞衰老。6、(E)-N-Q-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3バ4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼對膜整聯蛋白β 4表達的影響將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。對正常組細胞、對照組細胞和處理組三組細胞膜整聯蛋白β 4的表達進行熒光定量分析，結果見圖5。(注#ρ < 0. 05比照正常組，*ρ<0. 05比照對照組)。正常組細胞，含有血清和生長因子的Μ199培養液培養M小時，膜整聯蛋白β 4表達較低；對照組細胞，去除血清和生長因子后，膜整聯蛋白β4表達表達升高；處理組細胞，去除血清和生長因子后用(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1- (3- (6_氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼處理M小時，膜整聯蛋白β4表達表達下降。提示加入(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼可以降低膜整聯蛋白β 4在去除血清和生長因子培養細胞中的表達，抑制血管內皮細胞衰老。7、(Ε)-Ν_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼對活性氧水平的影響將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。對正常組細胞、對照組細胞和處理組三組細胞活性氧水平進行熒光定量分析，顯微鏡下結果見圖6。正常組細胞，含有血清和生長因子的M199培養液培養M小時，活性氧水平表達較低；對照組細胞，去除血清和生長因子M小時，活性氧水平比正常組顯著升高；處理組細胞，用(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理細胞M小時后，活性氧表達水平比對照組有所降低但是無明顯區別。結果表明加入(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)_3_(4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼可以降低活性氧水平但不顯著，一定程度上能抑制血管內皮細胞衰老。通過上述實驗及其結果，可以得出如下結論(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼濃度在40-80mg/L時，能有效抑制血管內皮細胞衰老和凋亡，預示 (E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內皮細胞衰老和凋亡藥物以及治療心血管疾病藥物中有很大的開發應用前景。


圖1 :(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼處理血管內皮細胞的顯微鏡下結果。其中=A 示正常組(48小時)；B 示對照組(48小時)；C 示經(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理后的血管內皮細胞(48小時)。圖2 熒光顯微鏡下所示(E)-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼處理M小時后的血管內皮細胞中核凝縮及核碎裂的結果。其中A為正常組；B為對照組；C為(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶) 甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理組。圖3 顯示Tunel染色標記凋亡細胞。其中A為正常組04小時)；B為對照組04小時)；C為處理組Q4小時)。圖4 β -半乳糖苷酶染色，顯示細胞衰老情況。其中Α為正常組04小時)；B為對照組04小時)；C為處理組Q4小時)。圖5 細胞膜整聯蛋白β 4的表達熒光定量分析結果統計。圖6 顯微鏡下示(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼對活性氧水平影響的結果。其中A為正常組04小時)；B為對照組04小時)；C為處理組Q4小時)。
具體實施例方式實施例1(E)-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼的制備1)在100毫升的圓底燒瓶中加入0.690克碳酸鉀(0. 005摩爾)，1. 230克3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-甲酸乙酯(0.005摩爾)，0.810克2-氯-5-氯甲基吡啶(0.005 摩爾)以及乙腈(25毫升)，裝置回流冷凝器，上部接干燥管。加熱回流4小時，反應至原料完全消耗，用TLC檢測反應終點。減壓濃縮，去除溶劑，加入乙酸乙酯(30毫升)，過濾，濾液濃縮，用乙酸乙酯-石油醚(V/ V = 1/2)作洗脫劑硅膠柱色譜分離剩余物(100 200目硅膠)，得到1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)吡唑-5-羧酸乙酯；2)在0.371克(0.001摩爾)1-(3-(6-氯吡啶)甲基)_3_甲氧基苯基)吡唑-5-羧酸乙酯的甲醇(5毫升)溶液中加入1. 2毫升80%的水合胼，攪拌回流反應1小時，反應至原料完全消耗，用TLC檢測反應終點。靜置過夜，析出固體，過濾，減壓抽濾得粗產物；用8毫升乙醇重結晶制得高純度1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基-IH-吡唑-5-碳酰胼；3)將得到的0.361克(0.001摩爾)1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼與0. 122克(0. 001摩爾)水楊醛加入到10毫升乙醇中，回流反應3小時，反應至原料完全消耗，用TLC檢測反應終點；靜置過夜，析出白色固體，過濾，減壓抽濾得粗產物；用12毫升乙醇重結晶制得高純度(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼。核磁共振數據如下1H-NMR (400MHz, CDC13+DMS0) δ :3. 77 (s, 3H, OCH3)，5. 76 (s, 2H, CH2)，
6.81-6. 92 (m, 5H, ArH, OH)，7. 20-7. 22 (m, 4H, ArH, PyH, 4-H)，7. 66 (d, J = 8. 4Hz,2H, ArH)，
7.68 (dd, J = 2. 2Hz，8. 4Hz, 1Η, PyH), 8. 35 (d, J = 2. 2Hz, 1H, PyH), 8. 45 (s, 1H, = CH)， 11. 85(s，1H, NH)。
紅外光譜數據如下IR(KBr)v :3560 (OH)，3209-2833 (NH)，1680 (C = 0) cm_10質譜數據如下MS(EI) :m/z 462·4(Μ+Η)+。實施例2將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的Μ199培養液培養；對照組細胞去處血清和生長因子培養；處理組細胞去除血清和生長因子后用40 80mg/L濃度的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理。三組細胞培養M小時后均用2%的甲醛、0. 5%戊二醛固定5分鐘，之后用不帶β -半乳糖染液洗一次，加入含β -半乳糖的染液在37°C無二氧化碳條件下孵育18- 小時。PBS清洗后觀察。對上述三組細胞隨機各選取10個視野，計數細胞總數和陽性細胞數，計算陽性率 (顯微鏡下結果見圖4)。結果顯示，正常組細胞陽性率較低；對照組細胞陽性率較正常組有顯著上升； (E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小時后的處理組細胞其陽性率顯著下降。提示(E)-N-Q-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼降低了陽性細胞比率，表明(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼能抑制血管內皮細胞衰老。實施例3將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養液培養；對照組細胞去處血清和生長因子培養；處理組細胞去除血清和生長因子后用40 80mg/L濃度的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理。三組細胞培養M小時后，棄去培養液，用4%的多聚甲醛固定15分鐘。用0. IM PBS清洗后， 加入正常血清封閉液。棄封閉液，加一抗，棄一抗加二抗，37°C下30分鐘，棄去二抗，用0. IM PBS清洗后觀察。對上述三組細胞膜整聯蛋白β 4的表達進行熒光定量分析。結果顯示，正常組細胞膜整聯蛋白β 4表達較低；對照組細胞β 4表達升高；處理組細胞用(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小時，β 4表達表達顯著下降(細胞膜整聯蛋白β 4的表達熒光定量分析結果統計見圖5)。提示(Ε)-Ν-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼可以降低膜整聯蛋白β 4在去除血清和生長因子培養細胞中的表達，抑制血管內皮細胞衰老。實施例4將所培養的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的Μ199培養液培養；對照組細胞去處血清和生長因子培養；處理組是將(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼配制成 5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、 100mg/L等濃度，分別加入以去除血清和生長因子的血管內皮細胞中，處理M小時。
在倒置顯微鏡下每4小時觀察一次細胞的生長變化，結果看到對照組細胞不斷地脫離培養板底面而漂浮于培養液中，然后細胞逐漸形成凋亡小體，即發生典型的細胞凋亡，24小時后僅有7%的細胞存活，β-半乳糖苷酶染色細胞陽性率較高達40% ； 而(Ε)-Ν-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼處理組細胞則較少發生凋亡，核片段化和DNA凝縮均受到抑制，此時的存活率為67 76%，β-半乳糖苷酶染色細胞陽性率下降至20%。說明(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼在所述實驗濃度下，均呈現出抑制血管內皮細胞凋亡和衰老的現象，特別是(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在40 80mg/L 濃度時，能有效抑制血管內皮細胞凋亡和衰老；60士 10mg/L濃度時更為經濟。
權利要求
1. (E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內皮細胞衰老和凋亡藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-碳酰肼在制備抑制血管內皮細胞衰老和凋亡藥物中的應用；其中能有效抑制凋亡、核片段化和DNA凝縮的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-碳酰肼的濃度是40～80mg/L。本發明為制備抑制血管內皮細胞衰老和凋亡藥物和治療心血管疾病又提供了一條開發和應用的途徑。
文檔編號A61P9/00GK102274225SQ20111016831
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月18日 優先權日2011年6月18日
發明者常宏文, 張尚立, 張恒, 王麗, 王萍, 馬劍峰 申請人:山東大學