專利名稱：一種去除調節性t細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，特別涉及一種去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法。背景技術：
腫瘤是各種致癌因素誘發細胞惡變和多種免疫細胞抗腫瘤監測殺傷功能兩種“陰陽” 機制互動失衡導致的惡性疾病。傳統的腫瘤治療主要是通過手術、化療與放療來達到早期根除腫瘤和減輕瘤負荷的目的，存在著腫瘤轉移與復發的危險性，具有損傷正常組織與免疫功能低下等嚴重副作用，導致目前臨床上腫瘤轉移、復發和死亡的幾率極高。腫瘤的免疫細胞治療是通過恢復與增強腫瘤患者自身的免疫監測和殺瘤功能，可以有效地殺滅患者術后和放化療后體內殘存的腫瘤細胞，達到治療腫瘤、預防復發與轉移和最終根治腫瘤的目的，具有特異性強、副作用輕等優點，正在逐步成為腫瘤綜合治療中的一個重要環節，也是當前腫瘤治療基礎研究和臨床應用的熱點與發展方向。根據誘導方法和來源的不同用于腫瘤生物治療效應細胞主要有腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)、細胞毒性T 細胞(T淋巴)等，由于一些細胞免疫治療因其效應細胞來源困難(如TIL)或治療副反應較大(如LAK)等原因，目前研究和報道越來越少；CIK雖然細胞增殖速度殺瘤活性高，殺瘤譜更廣，但是沒有特異性。目前普遍認為腫瘤抗原特異性T淋巴是腫瘤靶向治療最為理想的免疫效應細胞。目前腫瘤抗原特異性T淋巴的培養過程中，擴增的細胞是含⑶8+和⑶4+⑶25+ 異質性T細胞群，CD8+T淋巴細胞為機體最主要的抗腫瘤淋巴細胞群體，其中含有識別腫瘤抗原的特異性殺傷性T細胞，對腫瘤細胞進行特異性的殺傷；而CD4+CD25+T細胞亞群是一種免疫抑制細胞，又稱為調節性T細胞或Tregs (T-regulatory cells )，它表達CD3、 ⑶25和R)xP3，可抑制性調節⑶4+或⑶8+T細胞的活化與增殖，并能同時抑制初始T細胞與記憶性T細胞的增殖反應，從而達到負向調控免疫應答的作用，對在胸腺內不能形成自身耐受的自身反應性T細胞克隆有抑制作用；同時能抑制非己抗原誘發的免疫應答， Treg的顯著增加，導致腫瘤病人免疫監測與殺傷腫瘤功能的低下，最終抑制自身免疫反應和協助腫瘤的免疫逃避中發揮著重要作用，并導致疫苗誘導的抗腫瘤免疫應答的效用受到⑶4+⑶25+T細胞的限制。因選擇性地剔除患者體內Tregs細胞可能增強抗腫瘤免疫的功能，達到免疫殺瘤的療效。
發明內容
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種特異性好、殺傷力強的去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法。本發明是通過如下技術方案實現的
一種去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，主要包括如下步驟 (1)采集患者6(Tl20ml的自體外周血，分離其中的單核細胞和單個核細胞，置于全營養培養基中培養，分別誘導獲得CD8+及CD4+CD25+組成的異質性T淋巴細胞群和具有強大抗原提呈作用的DC細胞；
所述全營養培養基為添加青/鏈霉素和10%FBS的1640培養基，并將培養基置于C02 細胞孵育箱內放置2小時后收集懸浮液，離心獲得T淋巴細胞群，貼壁的DC細胞加DC培養基繼續培養，然后收集上清液，離心獲得DC細胞。(2) DC細胞用相應的腫瘤抗原刺激，使DC細胞在體外致敏，得到致敏的DC細胞； DC細胞置于無血清培養基中，加入相應的腫瘤特異性抗原蛋白，37°C下于C02孵育箱
內感染2小時，加入全營養培養基(含有20ng/mL的GM-CSF和IL-4)至^il，繼續培養M、8 小時，即得到誘導成熟的DC細胞。(3) T淋巴細胞群通過磁性分選，去除⑶4+⑶25+調節性T細胞(Tregs)，獲取 CD8+T淋巴細胞，去除了 Tregs細胞的抑制作用，增強了 T淋巴細胞殺傷腫瘤的作用；
(4)將致敏的DC細胞和分選出的CD8+T淋巴細胞混合培養，攜帶腫瘤抗原的DC細胞將抗原信息提呈給⑶8+T淋巴細胞并使之活化，得到特異性腫瘤疫苗DC-⑶8+ CTL0⑶8+T淋巴細胞和DC細胞按10:1的體積比混合，培養三天后加入IL_2 10U/mL, 及時分盤，每三天補充IL-2，14天后得到活化特異性腫瘤疫苗。本發明通過去除淋巴細胞中⑶4+⑶25+調節性T細胞，獲得了⑶8+T淋巴細胞，能夠大大增強T淋巴細胞殺傷腫瘤的作用，此細胞簡稱去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗 (Tregs-Deletion-Cancer- Vaccine, TDCV)。這種方法所擴增的細胞主要為殺傷性的⑶8+T淋巴細胞巴細胞，⑶8+ T淋巴細胞為機體最主要的抗腫瘤淋巴細胞群體，其中含有識別腫瘤抗原的特異性殺傷性T細胞，對腫瘤細胞進行特異性的殺傷。這種腫瘤疫苗回輸至患者體內后，DC激活的⑶8+T淋巴細胞能快速殺傷體內的腫瘤細胞，同時攜帶腫瘤抗原的DC細胞會繼續將抗原信息提呈給體內的CD8+T細胞并使之活化，從而誘導機體產生大量具有特異性細胞毒性功能的T淋巴細胞，對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用。本發明步驟簡捷，操作簡便，培養的細胞活化性好，對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用，有效治愈腫瘤疾病，適于廣泛推廣應用。
具體實施方式
實施例
所用試劑如下
肝素或枸櫞酸鈉抗凝管、Ficoll-Paque Plus、胎牛血清(FBS)、DPBS, IL_4、GM-CSF, IL-2、IL-6 ；
全營養培養基(CM) =RPMI 1640 (Invitrogen), 100U 的青霉素、100U 的鏈霉素，10%FBS。1. PBMCs的分離和培養
(1)抽取新鮮外周全血60-120mL，分成每份30mL于50mL離心管，加入6mLDPBS，緩慢加入 IOmL 的 Ficoll-Paque Plus ；
(2)離心(水平轉子)400g室溫20min；
(3)小心吸出位于紅細胞上的白色條帶，S卩外周血單個核細胞(PBMCs)；
(4)用DPBS30 mL稀釋PBMCs，室溫300g離心10 min,重復兩次，去除上清；
(5)將PBMCs合并，重新混懸于10-20mL CM中，進行細胞計數；(6)力口5-10mL1640培養基(含10%FBS)，加到25 CM培養瓶內，在CO2細胞孵育箱內放置2小時，讓細胞充分貼壁；
(7)輕搖培養瓶2-3min，以便未貼壁細胞充分懸浮，將培養瓶用1640培養基沖洗兩遍， 收集懸浮溶液，貼壁的細胞加DC培養基繼續培養，第6天開始，收集含有非貼壁細胞的培養上清，更換培養基，共兩天，合并所收集的上清，離心，脫離貼壁的細胞，即為未成熟的DCs ；
(8)收集到的懸浮溶液300g離心lOmin，收集到的細胞為異質性T淋巴細胞群。2. DC的誘導成熟
(1)特異性腫瘤抗原的制備
先將腫瘤組織在75%的酒精中浸泡10秒，立即置入無菌生理鹽水中浸泡5分鐘。然后將腫瘤組織置入適量的1640細胞培養液中，用無菌手術剪將其剪碎，放入低溫冰箱中反復凍融3次，用超聲波細胞破碎儀將腫瘤組織進一步打碎。離心除去細胞殘渣，上清液經 0. 22 μ針式過濾器過濾，用核酸蛋白測定儀標定蛋白含量，即特異性的腫瘤抗原。(2)腫瘤特異性抗原誘導DC的分化
IO6個DCs混懸于0. 5 mL的無血清培養基內，加入相應的腫瘤特異性抗原蛋白，37°C， CO2孵箱內感染2小時，加入CM至2 mL含GM-CSF 20ng/mL、IL_4 ng/mL，繼續培養M-48小時，即為誘導成熟的DC。3.⑶8+ T淋巴細胞的磁性分離
(1)將得到的異質性T淋巴細胞群懸浮液，兩次洗滌，分別300g離心，IOmin；
(2)臺盼藍染色計數；
(3)重懸細胞80uLbuffer (0. 5%BSA、2mM EDTA PH7. 2 PBS，真空抽濾除菌及液體內氣體)/107細胞，手工混勻；
(4)加入20uL CD8磁珠標記的抗體/IO7細胞；
(5)充分混勻，在2-8°C孵育15min；
(6)加入1-2mL buffer清洗/IO7細胞，然后加入10-20倍體積緩沖液300g離心， IOmin ；
(7)500 uL buffer溶液重懸108細胞；
(8)buffer緩沖液潤洗柱子；
(9)0.5mL細胞懸液過柱子進行磁性分選；
(10)收集未標記的陰選細胞，沖洗柱子三次；MS=3x500 uL，LS :3x3 mL ；
(11)從磁場中取下分離柱，插在適當的試管口上；用分選柱配備的活塞用力推盡液體， 沖出陽性結合的細胞。4. DC-CD8+ T 淋巴的誘導
⑶8+T淋巴細胞/DCs 10 :1混合，培養三天后，加入IL-2 10U/mL，及時分盤，每三天需補充IL-2，細胞分裂速度低于⑶4細胞，14天后用INF y ELISPOT法測活性?；罨募毎礊槿コ{節性T細胞的特異性腫瘤疫苗。綜上所述，DC-CD8+T淋巴細胞即為去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗，攜帶特異性腫瘤抗原的DC細胞會將抗原信息提呈給CD8+T淋巴細胞并使之活化，進而激活機體中有細胞毒性功能的T淋巴細胞，從而對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用。
權利要求
1.一種去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征為，主要包括如下步驟(1)采集患者6(Tl20ml的自體外周血，分離其中的單核細胞和單個核細胞，置于全營養培養基中培養，分別誘導獲得CD8+及CD4+CD25+組成的異質性T淋巴細胞群和具有強大抗原提呈作用的DC細胞；(2) DC細胞用相應的腫瘤抗原刺激，使DC在細胞在體外致敏，得到致敏的DC細胞；(3) T淋巴細胞群通過磁性分選，去除⑶4+⑶25+調節性T細胞(Tregs)， 獲取⑶8+T淋巴細胞；(4)將致敏的DC細胞和分選出的⑶8+T淋巴細胞混合培養，攜帶腫瘤抗原的DC細胞將抗原信息提呈給CD8+T淋巴細胞并使之活化，得到特異性腫瘤疫苗。
2.根據權利要求1所述的去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述全營養培養基為添加青/鏈霉素和10%FBS的1640培養基，并將培養基置于(X)2細胞孵育箱內放置2小時后收集懸浮液，離心獲得T淋巴細胞群，貼壁的DC細胞加DC培養基繼續培養，然后收集上清液，離心獲得DC細胞。
3.根據權利要求1或2所述的去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟(2)中，DC細胞置于無血清培養基中，加入相應的腫瘤特異性抗原蛋白，37°C 下于(X)2孵育箱內感染2小時，加入全營養培養基至anl，繼續培養M 48小時，即得到誘導成熟的DC細胞。
4.根據權利要求1或2所述的去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟(4)中，⑶8+T淋巴細胞和DC細胞按10:1的體積比混合，培養三天后加入IL-2 10U/mL，及時分盤，每三天補充IL-2，14天后得到活化特異性腫瘤疫苗。
5.根據權利要求3所述的去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于所述全營養培養基中含有20ng/mL的GM-CSF和IL-4。
全文摘要
本發明屬于生物醫學領域，特別公開了一種去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗的制備方法。本發明通過去除淋巴細胞中CD4+CD25+調節性T細胞，獲得了CD8+T淋巴細胞，能夠大大增強T淋巴細胞殺傷腫瘤的作用，此細胞簡稱去除調節性T細胞的特異性腫瘤疫苗。本發明步驟簡捷，操作簡便，培養的細胞活化性好，對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用，有效治愈腫瘤疾病，適于廣泛推廣應用。
文檔編號A61K39/00GK102319426SQ20111022561
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月8日 優先權日2011年8月8日
發明者刁曉娟, 孫理蘭, 張慧慧, 李榮榮, 王泰華 申請人:王泰華